接受拉米夫定治疗的慢性乙肝患者HBV反转录酶区新变异rtM204Q的表型特点分析

• 作者: 刘妍 姚增涛 徐东平 思兰兰 戴久增 王嫣 许智慧 陈丽
• 来源期刊: 解放军医学杂志
• 学科: 医学
• 关键词: 肝炎病毒,乙型 抗药性,病毒 突变
• 年，卷（期）: 2012,（6）
• 所属期刊栏目: 乙型肝炎病毒耐药基础研究专题
• 页码范围: 548-551
• 分类号: R512.62
• 语种: 中文

摘要

目的 分析乙肝病毒(HBV)反转录酶(RT)区YMDD功能域新变异rtM204Q的表型特点.方法 从1例接受拉米夫定(LAM)治疗的慢性乙肝患者血清中提取HBV DNA,扩增HBV全长RT区基因,PCR产物直接克降到pGEM-Teasy载体中,随机挑选40个克隆进行DNA序列测定并分析耐药相关变异.将Xho I/Sph I双酶切后的RT片段与载体连接成含HBV 1.1倍基因组长度的重组载体.采用FuGENE·HD试剂盒,将构建的含野生株和变异株的重组载体转染至人肝癌细胞系HepG2细胞.转染4h后加入不同浓度的核苷(酸)类药物[LAM终浓度为0、0.01、0.1、1、10、100μmol/L;阿德福韦酯(ADV)终浓度为0、0.033、0.1、0.33、1、3.3μmol/L;恩替卡韦(ETV)终浓度为0、0.001、0.01、0.1、1、10μmol/L；替诺福韦酯(TDF)终浓度为0、0.01、0.1、1、10、100μmol/L],隔天换药,连续作用4d后收集细胞上清,采用实时荧光定量PCR技术检测不同药物浓度下HBV DNA的复制水平,以分析变异株的表型特点.结果 对从患者血清获得的37个克隆进行测序分析,结果显示13个(35.1％)为野生型,11个(29.7％)为rtM204Q突变型,2个(5.4％)为rtM204I突变型,10个(27.0％)为rtA181T突变型,1个(2.7％)为rtA18 4T+rtM204Q突变型.后4种变异株的复制力分别是野生株复制力的89.95％、46.28％、55.77％和34.44％(P＜0.05).前2种变异形式的表型耐药分析结果显示,rtM204Q对LAM的敏感性为野生株的1/75.68,而rtM2041对LAM的敏感性不及野生株的1/1000.rtM204Q和rtM2 041株对ADV、ETV和TDF均敏感.结论 HBV RT区新的YQDD基序变异在一定程度上抑制病毒复制力,对LAM的敏感性降低,提示这可能是一个新的LAM耐药相关变异.