靶向EGFR隐蔽表位的免疫毒素的制备及其对肿瘤细胞的特异性杀伤

• 作者: 孔娟 李宗海 李雅婷 石必枝
• 来源期刊: 中国肿瘤生物治疗杂志
• 学科: 医学
• 关键词: 表皮生长因子受体 隐蔽表位 免疫毒素 单链抗体 铜绿假单胞菌外毒素A 肿瘤
• 年，卷（期）: 2013,（4）
• 所属期刊栏目: 基础研究
• 页码范围: 425-431
• 分类号: R392.4|R730.51
• 语种: 中文
• DOI: 10.3872/j.issn.1007-385X.2013.04.008

摘要

目的:制备靶向表皮生长因子受体(epithelial growth factor receptor,EGFR)隐蔽表位(287-302)的免疫毒素,并鉴定其生物学功能.方法:通过基因工程方法将抗EGFR(287-302)的806单链抗体(806 single-chain antibody fragment,806scFv)基因经柔性肽与铜绿假单胞菌外毒素A(Pseudomonas exotoxinA,PEA)的截短形式PE38KDEL连接,构建原核表达载体pET-22b-806scFv-PE38KDEL并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,经纯化获得该免疫毒素融合蛋白806scFv-PE38KDEL,ELISA和流式细胞术检测其与EGFR的结合活性,间接免疫荧光检测重组免疫毒索的内化作用,CCK-8法检测806scFv-PE38 KDEL对人脑胶质瘤细胞U87MG和U87MG-EGFRvⅢ、表皮癌细胞A431、乳腺癌细胞MDA-MB-468、舌癌细胞CAL-27的细胞毒性.结果:成功构建重组免疫毒素806scFv-PE38KDEL,诱导表达的蛋白806scFv-PE38KDEL以包涵体形式存在,经纯化后的纯度＞95％,经SDS-PAGE和Western blotting鉴定为目的蛋白.806scFv-PE38KDEL能EGFRvⅢ胞外段蛋白结合,还能与外源性表达EGFRvⅢ的肿瘤细胞和高表达EGFR的肿瘤细胞相结合,而与表达低水平EGFR的肿瘤细胞不结合.806scFv介导了重组免疫毒素的内化.806scFv-PE38KDEL对靶细胞有明显的杀伤作用,对过表达EGFRvⅢ的U87MG-EGFRvⅢ细胞IC50值为(5.85±0.03) ng/ml,对EGFR高表达细胞MDA-MB-468、A431、CAL-27的IC50值分别为(162.80±0.06)、(75.72±0.04)、(123.70 ±0.03) ng/ml.在1μg/ml的质量浓度下,相比PBS对照组,806scFv-PE38KDEL对U87MG-EGFRvⅢ、MDA-MB-468、A431和CAL-27细胞增殖的抑制率均显著增高[(98.67±0.07)％锱(2.45±2.85)％、(86.26±1.01)％仍(0.48±1.76)％、(96.72 ±0.16)％ vs (1.33 ±1.31)％、(96.29±0.30)％ vs (2.00±0.60)％,均P＜0.01],而对U87MG细胞几乎没有抑制作用[(3.59±2.09)％ vs (0.19±0.95),P＞0.05].结论:本研究所制备的靶向EGFR(287-302)表位的重组免疫毒素806scFv-PE38KDEL能特异地结合并杀伤EGFRvⅢ或EGFR高表达的肿瘤细胞.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	石必枝	上海交通大学医学院附属仁济医院上海市肿瘤研究所癌基因及相关基因国家重点实验室	6	12	3.0	3.0
2	李宗海	上海交通大学医学院附属仁济医院上海市肿瘤研究所癌基因及相关基因国家重点实验室	18	60	4.0	7.0
3	李雅婷	上海交通大学医学院附属仁济医院上海市肿瘤研究所癌基因及相关基因国家重点实验室	6	18	3.0	4.0
4	孔娟	上海交通大学医学院附属仁济医院上海市肿瘤研究所癌基因及相关基因国家重点实验室	1	3	1.0	1.0