TK1和TIMP1基因共表达载体的构建及其在大鼠血管平滑肌细胞中的表达

• 作者: 余惠珍 向红 张枫 朱鹏立 潘玮 黄舒洁
• 来源期刊: 中国医科大学学报
• 学科: 医学
• 关键词: 纽织激肽释放酶1基因 基质金属蛋白酶组织抑制物1基因 重组腺病毒载体 血管重构
• 年，卷（期）: 2013,（12）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 1072-1078
• 页数: 7页
• 分类号: R363
• 字数: 4971字
• 语种: 中文

摘要

目的 构建含人组织激肽释放酶1(hTK1)和基质金属蛋白酶组织抑制物(TIMP1)基因的重组腺病毒载体,并观察其在大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)中的表达.方法 选择相对应酶切位点,酶切合人TIMP1基因片段的原始质粒和腺病毒穿梭质粒pDC316,经连接、热激、转化等亚克隆而构建成重组穿梭质粒.之后,应用限制性内切酶BglⅡ/SalI,酶切合启动子和hTIMP1基因片段,再通过回收片段以及连接、热激等步骤亚克隆至pDC316-hTK1载体中,构建含双基因(hTK1和hTIMP1)的重组病毒穿梭质粒.利用AdMax腺病毒Cre/loxP重组酶系统,将该质粒和骨架病毒质粒于293A细胞中同源重组包装产生双基因的重组腺病毒载体.采用Western blot测定在VSMCs中的表达.结果 经PCR、双酶切和测序证实,重组病毒穿梭质粒pDC316-hTIMP1-EGFP和pDC316-hTK1-hTIMP1构建正确.在293A细胞里成功包装产生含双基因的重组腺病毒载体Ad5-hTK1-hTIMP1.感染VSMCs后,hTK1和hTIMP1蛋白呈独立高表达,表达水平呈浓度依赖性增加.结论 首次成功构建并包装了含双基因(hTK1和hTIMP1)的重组腺病毒载体,目的蛋白在VSMCs中呈现独立高表达,为血管重构性疾病的多个功能基因治疗奠定初步实验室基础.