携带免疫基因的前列腺癌特异性溶瘤腺病毒制备及功能验证

• 作者: 孙慧燕 张群伟 杨月峰 王华 王秀冬 王立生 肖凤君 薛淑雅
• 来源期刊: 军事医学
• 学科: 医学
• 关键词: 前列腺癌 溶瘤腺病毒 免疫基因
• 年，卷（期）: 2014,（3）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 207-211,233
• 页数: 6页
• 分类号: R34
• 字数: 4856字
• 语种: 中文
• DOI: 10.7644/j.issn.1674-9960.2014.03.011

摘要

目的制备前列腺癌特异性免疫溶瘤双功能腺病毒Ad-PL-PPT-E1A，评价其体外溶瘤和免疫激活功能。方法以LNCaP细胞和Jurkat细胞的cDNA为模板，采用普通PCR和巢式PCR分别扩增获得前列腺特异性抗原（ prostate specific antigen，PSA）基因、CD40L-N 基因和 CD40L-C 基因；并采用重叠 PCR 方法将 PSA、Linker、CD40L-N 和CD40L-C基因依次连接并扩增获得融合蛋白基因PSA-IZ-CD40L（PL）。采用以Adeasy系统为基础的溶瘤腺病毒构建体系，构建并制备携带PL的溶瘤重组腺病毒Ad-PL-PPT-E1A。以不同感染复数（multiplicity of infection， MOI）的溶瘤腺病毒Ad-PL-PPT-E1A感染PC3M细胞后不同时间点，流式细胞术检测细胞凋亡情况；50 MOI的Ad-PL-PPT-E1A感染PC3M细胞，于48 h收集其裂解液，并将其作用于正常人外周血单个核细胞，CCK8检测细胞增殖能力。结果 PCR成功扩增并连接获得融合蛋白基因PL，构建并制备了携带PL基因的溶瘤腺病毒Ad-PL-PPT-E1A。 RT-PCR和Western印迹检测结果显示，Ad-PL-PPT-E1A可在PC3M细胞中高效表达E1A和PL蛋白。将Ad-PL-PPT-E1A感染PC3M细胞后，可见明显的细胞病变；同时，流式细胞检测结果显示，当感染滴度达到200 MOI时，48 h的凋亡率达到70．67％±2．98％。 CCK8结果显示，Ad-PL-PPT-E1A感染后，可恢复PC3M细胞裂解液对人外周血单个核细胞的抑制作用。结论成功制备和鉴定了前列腺癌特异性免疫溶瘤双功能腺病毒Ad-PL-PPT-E1A，并在体外证实了其具有溶瘤和免疫的双重功能。