酿酒酵母TORC1信号通路重要调控元件Ego1/Eg03复合物的共表达及纯化

• 作者: 张勇 李昂 王玉炯 马瑞
• 来源期刊: 中国细胞生物学学报
• 关键词: TOR信号通路 EGO复合物 双元载体 蛋白纯化
• 年，卷（期）: 2014,（6）
• 所属期刊栏目: 研究论文
• 页码范围: 791-798
• 页数: 8页
• 语种: 中文
• DOI: 10.11844/cjcb.2014.06.0031

摘要

支架和连接蛋白在调节信号级联传导中起着重要作用.最近,Ego1/Ego3蛋白复合物被证实作为定位在细胞内体膜表面的支架蛋白在TORC1信号通路感知氨基酸丰度方面发挥重要调控作用.研究中通过克隆酵母Ego1与Ego3基因,构建了双T7启动子的双元原核表达载体.通过在大肠杆菌中共表达、共破菌以及带有不同抗性的两个质粒共转化的方法来重组表达Ego1/Ego3复合物.结果发现,Ego1可与Ego3蛋白形成可溶性的复合物,但纯化后蛋白比例存在明显差异,且Ego1有降解现象.通过构建一系列带组氨酸标签截短的Ego1与全长Ego3共表达,依靠pulldown纯化来鉴定Egol与Ego3相互作用的区段.最终发现,共转化pRSFDuet-mcs1 Ego1 (35-184)和pACYDuet-mcs1 Ego3可共表达、纯化到较稳定的比例较一致的复合物,从而为进一步对Ego 1/Ego3蛋白复合物进行生化鉴定和结构生物学研究奠定了基础.