甘蔗黄叶病毒P0蛋白分子特性及其抑制RNA沉默活性

• 作者: 傅华英 刘营航 林艺华 肖胜华 陈如凯 陈建生 高三基
• 来源期刊: 中国农业科学
• 关键词: 甘蔗黄叶病毒 P0蛋白 RNA沉默抑制子 黄色荧光蛋白
• 年，卷（期）: 2014,（23）
• 所属期刊栏目: 植物保护
• 页码范围: 4597-4606
• 页数: 10页
• 语种: 中文
• DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2014.23.008

摘要

【目的】甘蔗黄叶病（yellow leaf，YL）是一种主要的甘蔗病毒病害，在全球多数甘蔗种植国家或地区普遍发生，已对甘蔗生产造成严重威胁。其病原为甘蔗黄叶病毒（Sugarcaneyellowleafvirus，SCYLV），属于黄症病毒科马铃薯卷叶病毒属成员。研究SCYLV编码的沉默抑制子P0蛋白的分子特征、保守结构域及其在自然寄主甘蔗上抑制RNA沉默的功能，为下一步从RNA沉默水平解析SCYLV致病分子机理奠定基础。【方法】利用RT-PCR克隆技术获得SCYLV中国分离物CHN-FJ4编码的RNA沉默抑制子基因P0及其两个缺失突变体P0Δ2-15（N端缺失15个氨基酸）和P0Δ155-256（C端缺失102个氨基酸），然后定向克隆到单子叶植物表达载体pUbi-nos（空载体）上，获得重组质粒。利用甘蔗嫩叶组织瞬时表达系统鉴定病毒RNA沉默抑制子技术，结合ImageJ软件定量分析P0及其两个缺失突变体抑制外源基因EYFP瞬时表达活性的变化。番茄丛矮病毒（Tomato bushy stunt virus，TBSV）编码的P19作为沉默抑制子阳性对照。【结果】P0核苷酸序列的遗传进化分析结果显示，所获得的SCYLV病毒分离物CHN-FJ4为BRA基因型，与其他BRA基因型分离物氨基酸序列一致性为96.1%—98.4%。利用MEME在线软件预测P0蛋白的保守结构域，结果表明P0蛋白含有3个显著的保守区。分别位于第1—60、76—125和161—210氨基酸残基。通过Datamonkey在线服务器（http：//www.datamonkey.org）提供的5种运算方法分析P0蛋白氨基酸位点的选择压力，结果显示P0蛋白具有8个氨基酸正向选择位点。将含有P0及其缺失突变体的重组质粒连同含EYFP报告基因的pTEM12质粒采用基因枪轰击法分别导入甘蔗嫩叶组织细胞，轰击后48—120 h，P0和P19逐渐地提高EYFP荧光表达点数和荧光表达水平；在120 h，与pUbi-nos空载体（不含沉默抑制子）对照组相比， P0和P19均显著地提高甘蔗嫩叶组织EYFP荧光表达点数和荧光表达水平，分别达1.6倍和4.0倍以上。P0与P19抑制RNA沉默活性水平没有显著差异（P>0.05）。P0蛋白N端缺失15个氨基酸（P0Δ2-15）和C端缺失102个氨基酸（P0Δ155-256）均丧失了沉默抑制子的功能，荧光表达与不含沉默抑制子对照组相当。【结论】在甘蔗嫩叶组织EYFP瞬时表达体系上，P0能够显著地提高外源基因EYFP表达水平。P0蛋白N端15个氨基酸和C端102个氨基酸含有显著的保守区域，是P0发挥沉默抑制子功能所必需的。