蛋白激酶D1催化结构域在昆虫细胞/杆状病毒表达系统内的表达、纯化和活性测定

• 作者: Qiming Jane Wang 李志红
• 来源期刊: 生物工程学报
• 关键词: 蛋白激酶D 催化结构域 昆虫细胞 杆状病毒表达系统 表达 纯化
• 年，卷（期）: 2014,（8）
• 所属期刊栏目: 生物技术与方法
• 页码范围: 1291-1298
• 语种: 中文
• DOI: 10.13345/j.cjb.130517

摘要

蛋白激酶D (Protein kinase D,PKD)是一种新的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族和甘油二酯(Diacylglycerol,DAG)受体,参与细胞内多种生理生化过程.为获得高纯度的PKD1的催化结构域(PKD1-cat)用于晶体学结构的研究,将带有GST标签的PKD1-cat基因克隆到杆状病毒转移载体pFastBac1中,构建了重组质粒.将重组质粒转化到含穿梭载体Bacmid的DH10Bac感受态细胞中,转座后获得了含目的基因GST-PKD 1-cat的重组Bacmid.重组Bacmid DNA转染Sf9昆虫细胞后,获得重组杆状病毒并扩毒.将毒种以5 PFU/cell的感染复数感染悬浮培养的T.ni昆虫细胞,SDS-PAGE和Western blotting检测表达产物.结果显示,表达产物在分子量约68 kDa处有一特异条带可与GST单克隆抗体发生反应.经谷胱甘肽琼脂糖凝胶亲和层析纯化和PreScission Protease切除GST标签后,得到了纯度很高的分子量约42 kDa的目的蛋白PKD1-cat.体外PKD激酶活性实验结果显示,随着PKD1-cat浓度的增加,激酶活性增高.这些结果显示截短的重组PKD1-cat有很高的催化活性和纯度,为采用核磁共振或晶体学方法解析PKD1-cat的三维结构奠定了基础.