人丙氨酸转氨酶高效重组表达体系的构建

• 作者: 刘艳 徐超 杨昭鹏 王玉梅 高尚先
• 来源期刊: 中华检验医学杂志
• 关键词: 丙氨酸转氨酶 重组蛋白质类 密码子 参考标准
• 年，卷（期）: 2014,（10）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 767-771
• 页数: 5页
• 字数: 3680字
• 语种: 中文

摘要

目的：构建人丙氨酸转氨酶（ ALT）高效重组表达体系，为ALT相关参考物质的原料制备奠定基础。方法利用生物信息学方法优化编码人ALT核苷酸序列中的密码子，合成人ALT新的基因，并将其克隆至pRSF-Duet表达载体中。重组表达质粒pRSF-Duet-ALT转化大肠埃希菌BL21，以2 mmol/L的异丙基硫代半乳糖苷（ IPTG）诱导目的蛋白的表达，并通过改变诱导剂浓度、振摇速度及诱导温度优化表达条件，以产生可溶性蛋白。可溶性蛋白经镍离子柱亲和层析及分子筛层析纯化，以十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（ SDS-PAGE）及蛋白质免疫印迹（ Western blot）鉴定蛋白的性质，并对重组蛋白的活性、不同储存条件下在血清基质中的稳定性进行检测。结果经过优化的ALT核苷酸密码子在大肠埃希菌中的使用频率均在10％以上；经表达优化，在IPTG 终浓度为2 mmol/L、25℃、150 rpm振摇8 h诱导条件下，可增加可溶性蛋白的产率；纯化后的目的蛋白经电泳及免疫印迹鉴定为谷丙转氨酶，活性可达80000 U/L。重组ALT在2～8℃、25℃均可稳定2～8 d，相对偏差均在5％以内。结论通过密码子优化，成功构建了重组ALT的高效表达系统，本重组蛋白可以达到作为参考物质原料的要求。（中华检验医学杂志，2014，37：767-771）

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	高尚先		28	35	4.0	4.0
2	王玉梅		21	30	4.0	4.0
3	杨昭鹏		39	133	6.0	10.0
4	刘艳		42	60	5.0	6.0
5	徐超		6	4	1.0	2.0