氟喹诺酮类药物多残留酶联免疫检测方法的建立

• 作者: 单晓峰 姜金庆 康元环 李新朋 李艺 王自良 范国英 钱爱东
• 来源期刊: 中国农业科学
• 关键词: 环丙沙星 氟喹诺酮类药物 杂交瘤细胞株 广谱特异性单克隆抗体 间接竞争ELISA
• 年，卷（期）: 2014,（23）
• 所属期刊栏目: 畜牧?兽医?资源昆虫
• 页码范围: 4696-4705
• 页数: 10页
• 语种: 中文
• DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2014.23.017

摘要

【目的】氟喹诺酮类药物（FQs）在畜牧业中广泛用于预防和治疗细菌性疾病，不合理使用导致在动物性食品中残留，严重危害消费者健康，其检测受到世界各国重视。制备抗多种FQs单克隆抗体（mAbs），建立间接竞争 ELISA（icELISA）检测方法，为动物性食品中 FQs 多残留检测奠定基础。【方法】环丙沙星（CPFX）羧基上引入氨基丁酸后为半抗原（CPFX-A），质谱鉴定；分别用碳二亚胺法（DDC）和混合酸干法将半抗原与牛血清白蛋白（BSA）和卵清蛋白（OVA）偶联合成免疫原（CPFX-A-BSA）和包被原（CPFX-A-OVA），紫外和红外光谱鉴定是否偶联成功；CPFX-A-BSA 免疫Balb/c小鼠，间接ELISA和icELISA方法测定多抗血清效价和敏感性，选取抗血清效价高和敏感性好的鼠用于细胞融合；NS0细胞和脾细胞按1﹕5比例在PEG-1500作用下融合，筛选抗FQs杂交瘤细胞株，并进行效价、亚型、敏感性和交叉反应率鉴定；体内诱生腹水法制备 mAb，液体石蜡作为诱导剂，每只鼠注射108个杂交瘤细胞；选敏感性和广谱特异性好的腹水mAb，建立icELISA标准曲线，对icELISA检测方法优化，在鸡肉中添加10种FQs进行测定，将测定结果与HPLC法比较，用SPSS 17.0软件进行显著差异性分析。【结果】半抗原改造和人工抗原合成成功；3只鼠血清效价均达到1﹕1.28×104以上，2号鼠血清效价最高（1﹕2.56×104），且IC50值最低（12.92 ng·mL-1），选择2号鼠作为细胞融合用鼠；4次亚克隆筛选并鉴定后获得3株敏感广谱特异的杂交瘤细胞，分别命名为2H5、3D11、4F4，细胞上清效价分别为1﹕1600、1﹕1600和1﹕800，腹水效价分别为1﹕1.6×106、1﹕8.2×105和1﹕8.2×105；icELISA方法的包被原浓度为1μg·mL-1，5%猪阴性血清4℃包被过夜，单抗1﹕40000稀释，山羊抗鼠酶标二抗（GaMIgG-HRP）1﹕8000稀释；反应温度均为37℃，标准品与单抗同时加入反应15 min，洗板后加二抗反应25 min；显色10 min，2H5细胞株腹水敏感性和广谱特异性最好，2H5的线性回归方程为y=-28.022x+56.219，R2=0.9782，对10种FQs的IC50值分别为环丙沙星（CPFX）1.67 ng·mL-1、诺氟沙星（NOR）1.82 ng·mL-1、培氟沙星（PEF）1.97 ng·mL-1、恩诺沙星（ENR）1.54 ng·mL-1、单诺沙星（DAN）2.79 ng·mL-1、洛美沙星（LOM）3.38 ng·mL-1、氧氟沙星（OFL）5.50 ng·mL-1、麻保沙星（MAR）4.40 ng·mL-1、沙拉沙星（SAR）11.76 ng·mL-1、二氟沙星（DIF）13.60 ng·mL-1，与10种FQs的交叉反应率为12.3%—108.4%，与非 FQs交叉反应率均低于0.01%，对10种FQs的检测限（LODs）为0.09 ng·mL-1—0.64 ng·mL-1。icELISA法鸡肉中10种FQs的回收率为80.5%—91.8%，HPLC法的回收率为85.1%—95.7%，二者变异系数均低于10.0%；两种检测方法差异不显著（P＞0.05）。【结论】该试验获得了高效价、敏感、广谱特异性的mAbs，建立的icELISA方法可用于同时检测鸡肉中10种FQs。