人脑源性神经营养因子和神经营养素3真核双表达载体的构建与鉴定

• 作者: 丰慧根 李卫东 林俊堂 栗炳南
• 来源期刊: 中国组织工程研究
• 学科: 医学
• 关键词: 组织构建 组织工程 脑源性神经营养因子 神经营养素3 真核双表达载体 转染 双PCR
• 年，卷（期）: 2014,（15）
• 所属期刊栏目: 技术与方法 -- 组织构建与生物活性因子
• 页码范围: 2369-2376
• 页数: 8页
• 分类号: R318
• 字数: 1349字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.15.013

摘要

背景：脑源性神经营养因子(brain-derived&nbsp；neurotrophic factor，BDNF)和神经营养素3(Neurotrophines-3，NT-3)在细胞分化过程中有重要作用。病毒载体临床应用存在安全隐患，利用真核表达载体表达蛋白为解决安全性问题提供了一种方法。目的：构建双基因共表达载体pIRES 2-BDNF-NT-3并对其进行鉴定。方法： BDNF和NT-3基因核心序列是通过直接PCR的方法从外周血单个核细胞的基因组DNA中获取。然后将BDNF的cDNA片段插入到pIRES2-EGFP多克隆位点构建pIRES2-BDNF-EGFP载体，随后将NT-3 cDNA片段以替换EGFP的方式插入pIRES2-BDNF-EGFP中，最后构建成为含有内部核糖体进入位点(IRES)的pIRES2-BDNF-NT-3双基因共表达载体。实验通过双酶切和DNA测序方法对其鉴定，将重组的双基因共表达载体感染HEK293细胞，利用RT-PCR与Western-blot方法检测双基因的表达。 <br>　　结果与结论：DNA测序显示，提取的BDNF和NT-3均与基因库报道序列一致。构建的pIRES 2-BDNF-NT-3双基因共表达载体经Eco RⅠ/Bam HⅠ切出BDNF条带，经Bam HⅠ/NotⅠ双酶切后切出IRES-NT-3片段，经Eco RⅠ/NotⅠ双酶切后切出BDNF-IRES-NT-3片段。RT-PCR与Western-blot方法检测显示，此载体转染后的HEK293细胞均能表达BDNF和NT-3 mRNA和蛋白。结果证实，实验成功采用IRES序列构建了能分别表达的 BDNF 和 NT-3双基因真核表达载体。

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	丰慧根	新乡医学院生命科学技术学院	75	167	6.0	8.0
2	林俊堂	新乡医学院生命科学技术学院	61	101	5.0	6.0
3	李卫东	新乡医学院生命科学技术学院	7	2	1.0	1.0
4	栗炳南	新乡医学院生命科学技术学院	4	1	1.0	1.0