黄瓜 LDC 克隆、表达载体的构建及烟草转化研究

• 作者: 李振兴 简兴 苗永美 边卓吾 陈存款 隋益虎 黄春景
• 来源期刊: 广西植物
• 学科: 生物学
• 关键词: 黄瓜 赖氨酸脱羧酶 烟草 遗传转化
• 年，卷（期）: 2015,（2）
• 所属期刊栏目: 遗传与育种
• 页码范围: 255-260,165
• 页数: 7页
• 分类号: Q943.2
• 字数: 4913字
• 语种: 中文
• DOI: 10.11931/guihaia.gxzw201312015

摘要

赖氨酸脱羧酶(LDC)催化赖氨酸脱羧形成尸胺.该研究采用 RT-PCR 技术从耐冷黄瓜‘Chipper’中分离到一段 cDNA 序列,利用 DNAMAN6．0软件进行氨基酸序列分析,用 BLASTp 对蛋白的保守序列进行比对,用双酶切法和 T4DNA 连接酶构建了植物超表达载体 pCAMBIA1304-LDC ,通过在烟草不定芽诱导和生长培养基中添加不同浓度的潮霉素(Hyg)以确定不定芽分化和生长的筛选压力浓度,同时优化了菌液浓度、侵染时间和预、共培养时间4个农杆菌侵染条件.结果表明：该序列的 CDS 全长具有648 bp,编码216个氨基酸,BLASTp 结果显示该蛋白具有赖氨酸脱羧酶的保守序列,认为分离到的序列为黄瓜 LDC 基因,在GenBank 中的登录号是 KC202438；当在叶块不定芽诱导培养基中添加10 mg?L-1的 Hyg 时,芽诱导率明显降低,为5．41％；当芽生长培养基中的 Hyg 浓度为20 mg?L-1时,芽苗成活率为33．33％,明显低于对照,因此认为10 mg?L-1和20 mg?L-1的 Hyg 浓度是抗性芽诱导和生长的筛选浓度；农杆菌侵染时,烟草叶盘不需要预培养,农杆菌 OD600值为0．6,侵染5 min、共培养4 d 时,侵染效果最好,能获得较高的抗性芽分化率.获得的抗性植株移栽成活后,叶片 DNA 经过 PCR 鉴定,获得了29株转化植株,转化率达93．55％.转化植株的获得为下一步基因功能分析提供了材料.