多转座子载体的构建及转座特性比较研究

• 作者: 史云强 宋成义 崔恒宓 李庆平 沈丹 王赛赛 薛松磊 谢雨琇 钱跃 陈才 高波
• 来源期刊: 中国农业科学
• 关键词: SB转座子 PB转座子 Tol2转座子 胚胎成纤维细胞 转座活性
• 年，卷（期）: 2015,（11）
• 所属期刊栏目: 畜牧?兽医?资源昆虫
• 页码范围: 2270-2278
• 页数: 9页
• 语种: 中文
• DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2015.11.018

摘要

【目的】转座子（transposon, Tn）是染色体上可自主复制和移位的基本单位，普遍存在生物体基因组内，Sleeping beauty（SB）、piggyBac（PB）和Tol2分别来源于鲑鱼、甘蓝尺蠖蛾和青鳉鱼，是目前脊椎动物中活性较高的转座子。比较了这3种转座子在哺乳动物细胞的转染、插入和剪切效率，从而获得细胞水平上的高活性转座子系统。【方法】通过高保真PCR法分别从SB、PB和Tol23种转座子载体克隆3种转座子3′和5′端的转座元件，测序正确后，将各转座元件依次亚克隆至 pT2-HB 载体框架，构建成包含这3种转座子的多转座子载体pT3-PST。将绿色荧光蛋白表达框CAG-GFP和新霉素表达框PGK-NEO分别克隆至pT3-PST载体，获得两个表达载体pT3-PST-CAG-GFP和pT3-PGK-NEO。将这两个表达载体分别和转座酶表达质粒pCMV-SB100X、 pCMV-HAhyPBase、pCMV-Tol2以1﹕1质量比混合，经多聚阳离子PEI包裹，共转染小鼠胚胎成纤维细胞（3T3），同时以突变失活的转座酶质粒SB△DD与转座子载体共转染作为阴性对照组。转染GFP 36 h后，用荧光显微镜进行检测GFP表达率，提取细胞基因组，以Amp基因作为内参，进行实时荧光定量PCR，检测GFP插入拷贝数；根据被剪切位置上下游序列设计引物，进行实时荧光定量PCR，检测3种转座子的剪切效率。细胞转染NEO 48 h后，用浓度为500μg·mL-1的G418进行耐药性筛选，至正常细胞基本全部死亡（10 d），将细胞进行吉姆萨染液染色，统计耐药细胞数，从而比较各组转座活性。【结果】成功构建了多转座子载体 PT3-PST、pT3-PST-CAG-GFP和pT3-PGK-NEO。实验组转染细胞效率均大于50%，且差异不显著（P＞0.05）。SB组GFP相对拷贝数高于Tol2和PB组，但差异不显著（P＞0.05），均显著高于对照组（P＜0.05）。SB和PB组剪切效率显著高于Tol2组（P＜0.05），但SB和PB组之间差异不显著（P＞0.05）。pT3-PGK-NEO与转座酶共转染3T3细胞，G418抗性筛选结果表明，SB组耐药细胞数显著高于PB和Tol2组（P＜0.05），但PB和Tol2两组差异不显著（P＞0.05），此3组均极显著高于阴性对照组（P＜0.01）。【结论】SB转座子系统在细胞水平的转座效率优于PB和Tol2，为细胞水平的转基因研究提供有效基因转移工具。