下调人脐带间充质干细胞Mbd3基因shRNA慢病毒的构建及鉴定

• 作者: 周艳 孙茂盛 张磊 李溪 李鸿钧 解裕萍 闫姗姗
• 来源期刊: 生物学杂志
• 学科: 医学
• 关键词: Mbd3基因 基因沉默 慢病毒载体 RNA干扰
• 年，卷（期）: 2015,（3）
• 所属期刊栏目: 研究报告
• 页码范围: 15-20
• 页数: 6页
• 分类号: Q782|R556.5
• 字数: 5276字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.2095-1736.2015.03.015

摘要

研究构建靶向抑制人Mbd3表达的shRNA慢病毒颗粒，感染人脐带间充质干细胞并用嘌呤霉素筛选获得Mbd3稳定下调的细胞系，为进一步探讨Mbd3在诱导型多潜能干细胞形成中的作用提供实验基础。研究根据Gene Bank中公布的Mbd3基因序列设计特异性siRNA干扰序列并合成可产生shRNA的双链DNA，经双酶切后克隆至pLVshRNA-EGFP(2A)Puro载体上构建慢病毒重组质粒，转化DH5α大肠杆菌PCR检测筛选阳性质粒，利用HEK293Ta包装产生含有Mbd3shRNA的慢病毒颗粒。通过RT-PCR和Western blot检测慢病毒感染人脐带间充质干细胞（hUC-MSC）后Mbd3的转录和蛋白表达情况，进一步检测重组慢病毒对Mbd3的沉默效果并筛选出最佳抑制效果的shRNA慢病毒载体。结果显示成功构建并筛选出下调Mbd3的最佳慢病毒干扰载体，慢病毒感染人脐带间充质干细胞48h后于荧光显微镜下可见绿色荧光，经嘌呤霉素筛选9 d后，RT-PCR检测Mbd3表达显著降低， Western blot检测Mbd3蛋白表达明显减少。说明构建的shRNA重组慢病毒包装成功，具有较高的感染活性，可有效抑制人脐带间充质干细胞Mbd3的表达，为后续研究脐带间充质干细胞跨胚层分化打下前期研究基础。