牙龈卟啉单胞菌c-di-AMP代谢相关基因的克隆及表达纯化

• 作者: 周学东 李雨庆 程兴群 邱伟
• 来源期刊: 华西口腔医学杂志
• 学科: 医学
• 关键词: 牙龈卟啉单胞菌 c-di-AMP 代谢基因 表达纯化
• 年，卷（期）: 2015,（6）
• 所属期刊栏目: 口腔微生物学专栏
• 页码范围: 607-612
• 页数: 6页
• 分类号: R780.2
• 字数: 4892字
• 语种: 中文
• DOI: 10.7518/hxkq.2015.06.012

摘要

目的 克隆牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)中负责c-di-AMP代谢的相关基因,并使其在大肠杆菌中正确表达及高效纯化.方法 通过聚合酶链反应(PCR)克隆牙龈卟啉单胞菌ATCC33277的pgn0523、pgn1187和pgn2003三个基因,经过酶切后将目的基因片段与大肠杆菌表达质粒pET28a连接,分别构建出重组表达质粒pET-pgn0523、pET-pgn1187和pET-pgn2003.将重组表达质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,用异丙基-p-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组蛋白,通过十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析和鉴定.用镍离子金属亲和层析法对重组蛋白进行分离纯化,BCA法检测目的蛋白的浓度.结果 目的基因pgn0523、pgn1187和pgn2003扩增产物条带与预期大小一致.重组表达质粒pET-pgn0523、pET-pgn1187和pET-pgn2003及其PCR产物琼脂糖凝胶电泳验证与预期大小相符,测序结果与GenBank中牙龈卟啉单胞菌ATCC33277国际标准菌株的基因序列100％一致.IPTG诱导后的菌体经SDS-PAGE检测得到3个大小分别为19.5×103、39.9×103、66.0×103的蛋白质增强条带,与预期大小相符.镍离子金属亲和层析柱纯化得到的蛋白与预期目的蛋白分子量一致,BCA法测定目的蛋白的浓度分别为0.708、0.523和0.861 mg.mL-1.结论 本研究成功克隆并表达纯化了牙龈卟啉单胞菌c-di-AMP代谢相关蛋白,得到了较高浓度和纯度的目的蛋白,为进一步探究牙龈卟啉单胞菌c-di-AMP的生理功能及体内代谢途径奠定了基础.