应用Pull-down方法检测草鱼恒定链(Ii)与主要组织相容性复合体(MHC)分子的结合

• 作者: 余为一 刘洪明 张娅菲 杨磊 杨聪莺 林海斌 罗兰芳 陈芳芳
• 来源期刊: 农业生物技术学报
• 关键词: 草鱼 恒定链(Ii) 主要组织相容性复合体(MHC) 原核共转染
• 年，卷（期）: 2015,（6）
• 所属期刊栏目: 研究论文与报告
• 页码范围: 772-778
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1674-7968.2015.06.009

摘要

恒定链(invariant chain,Ii)能结合主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)Ⅰ类和Ⅱ类分子,并在MHC递呈抗原中起重要辅助作用.为了探讨鱼类Ii和MHC分子体外结合关系,本研究采用Pull-down方法检测草鱼(Ctenopharyngodon idellus) Ii与MHC Ⅰ类或Ⅱ类分子的结合.克隆草鱼Ii (711 bp)、Mhc Ⅰ α (540 bp)和MhcⅡβ(549 bp)基因片段,再将其分别插入原核表达质粒PET-22b(无His标签)或PET-28a(含His标签)中,构建了3个重组质粒PET-22b-Ii、PET-28a-Mhc Ⅰ α和PET-28a-MhcⅡβ.然后分别转染工程菌大肠杆菌(Escherichia coli) Rosetta(DE3),进行诱导表达、纯化和聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)鉴定.结果表明,含His标签的MHC Ⅰα和MHCⅡβ不仅表达,而且可高效纯化,其相对分子质量约为24 kD;Western blot结果表明,Ii可表达,相对分子质量约为30 kD.将PET-22b-Ii与PET-28a-Mhc Ⅰ α或PET-28a-MhcⅡβ分别共转染Rosetta (DE3),构建了重组菌Rosetta(DE3) (PET-28a-Mhc Ⅰ α+PET-22b-Ii)和Rosetta(DE3) (PET-28a-MhcⅡβ+PET-22b-Ii).经诱导表达和PAGE检测发现,MHC Ⅰα和MHCⅡβ分别结合Ii,形成相对分子质量为54 kD的复合物;SDS处理后,分别被解离形成单分子Ii(30 kD)以及MHC Ⅰα或MHCⅡβ (24 kD).在Western blot中,解离后的Ii可与特异性多克隆抗体结合并被电化学发光(electrogenerated chemiluminescence,ECL)显色.综上所述,草鱼Ii可以分别与MHCⅡβ和MHC Ⅰα结合,为进一步研究动物Ii与MHC分子的关系提供了基础资料.