采用特异性探针药物法测定双峰驼CYP3A酶活性

• 作者: 哈斯苏荣 张文彬 裴乐
• 来源期刊: 中国农业科学
• 关键词: 双峰驼 CYP3A酶 高效液相色谱法 探针药物
• 年，卷（期）: 2015,（16）
• 所属期刊栏目: 畜牧?兽医?资源昆虫
• 页码范围: 3266-3274
• 页数: 9页
• 语种: 中文
• DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2015.16.016

摘要

【目的】探究双峰驼 CYP3A 酶体外活性及其对外源性药物代谢的影响。【方法】将双峰驼禁食过夜12 h，颈静脉放血处死后，立即于肝门静脉处采集块状肝脏组织，洗去血污称重匀浆后，采用 Ca2+沉淀法制备双峰驼肝微粒体，并通过 BCA法测定其蛋白含量。同时优化双峰驼肝微粒孵育体系，取不同浓度的双峰驼肝微粒体蛋白悬液（0.016、0.031、0.063、0.125、0.250、0.500、1.000、2.000 mg·mL-1）、不同浓度的探针药物咪达唑仑（MDZ）（7.813、15.625、31.250、62.500、125、250、500、1000μg·mL-1）分别加入到孵育体系中，37℃预孵育5 min后，加入NADPH溶液后再孵育不同时间（0、2、5、10、15、20、25、30 min）。待反应完全后加入冰冷的甲醇和地西泮（DZP）溶液，涡旋混匀，800μL 全部混合液体经14500 r/min 离心20 min 后，取20μL 上清液进行高效液相色谱紫外检测（HPLC-UV），确定最适底物浓度、最适酶浓度以及最适孵育时间。分别取浓度为7.813、15.625、31.250、62.500、125、250、500、1000μg·mL-1 MDZ 探针药物溶液20μL 与双峰驼肝微粒体共同孵育15 min 后，以混有内标 DZP 的冰冷甲醇终止反应，采用高效液相色谱紫外检测法测定反应产物1'-羟基咪达唑仑（1'-OHMDZ）的动态含量，计算出部分药物动力学参数。色谱条件：Sigma-Aldrich/Supelco Discovery C18色谱柱（150 mm×4.6 mm，5μm）；流动相为V（乙腈）﹕V（0.01 mol·L-1 PBS缓冲液）=40﹕60；等浓度洗脱20 min；检测波长为254 nm；流速为0.8 mL·min-1；柱温为30℃；进样量为20μL。【结果】使用 Ca2+沉淀法制备的双峰驼肝微粒体保持了酶的良好活性，能满足后续体外药物代谢试验的基本要求，经BCA法测定其蛋白含量为(1.936±0.052) mg·mL-1。双峰驼肝微粒体蛋白悬液、探针药物 MDZ、PBS 缓冲液、MgCl2溶液以及 NADPH 溶液构成双峰驼肝微粒体孵育体系，随着孵育时间的延长，酶和底物进一步反应，当MDZ浓度为125μg·mL-1（终浓度为7.073 nmol·mL-1），肝微粒体浓度为2.000 mg·mL-1（终浓度为0.050 mg·mL-1）时，孵育15 min，酶和底物的结合最紧密，并呈现出饱和的状态，故确定其终浓度和时间为最适浓度和最佳孵育时间。经HPLC-UV法测定，1'-OHMDZ、MDZ和DZP的出峰保留时间分别为6.710、11.383和15.263 min，各成分色谱峰分离良好，且不受肝微粒体孵育体系中其他干扰峰的影响。HPLC 检测方法的精密度、稳定性及回收率的试验结果均符合色谱测定的基本要求，即成功建立了准确、灵敏、可靠、重现性好的双峰驼CYP3A酶特异性探针药物的检测方法。以底物 MDZ浓度和反应产物1'-OHMDZ生成速率进行 Lineweaver-Burk双倒数作图，分别计算出最大反应速度Vmax 和米氏常数 Km。经 Origin Pro8.6软件进行线性回归分析得到最大反应速度 Vmax 为(0.380±0.028)nmol·mg-1·min-1，米氏常数 Km为(9.603±3.229)nmol·mL-1，以此体现酶和底物的反应情况，并对双峰驼CYP3A酶的活性进行了间接测定。【结论】成功建立了跟踪检测CYP3A酶的特异性探针药物MDZ及其代谢产物浓度的高效液相色谱紫外检测方法。MDZ在体内经CYP3A酶的特异性氧化代谢后主要生成1'-OHMDZ，本文以MDZ的代谢产物1'-OHMDZ的生成速率为检测指标，首次对双峰驼CYP3A酶的体外活性及酶与底物的相互作用特点进行了研究。