基于CRISPR/Cas9系统对斑马鱼hoxb4基因的编辑及其突变体基因型的初筛

• 作者: 何志旭 刘丰 李燕 舒莉萍 袁家侃 袁梦
• 来源期刊: 生物技术通报
• 关键词: 斑马鱼hoxb4基因 CRISPR/Cas9 基因组编辑 突变筛选
• 年，卷（期）: 2015,（10）
• 所属期刊栏目: 研究报告
• 页码范围: 249-254
• 页数: 6页
• 语种: 中文
• DOI: 10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.10.004

摘要

采用高效基因编辑系统CRISPR/Cas9构建hoxb4基因敲除斑马鱼模型，进行hoxb4基因功能的研究。根据hoxb4基因的一号外显子的正义链及反义链设计3个长20 bp的sgRNA，分别靶向ExonⅠ的192#位点，244#位点及313#位点。化学合成sgRNA的寡核苷酸序列，经过酶切克隆进pT7-gRNA质粒中，构建gRNA的体外转录载体并通过体外转录得到靶位点的gRNA。将质粒pSP6-2sNLS-spCas9线性化然后在体外转录得到Cas9的mRNA并进行加A尾，将以上靶位点的gRNA与Cas9的mRNA共注射入单细胞期的斑马鱼胚胎内，提取基因组DNA，PCR扩增出目的基因片段并使用T7EI酶切测效，最后将PCR产物连入pMD19-T simple载体中，挑取阳性克隆进行菌落PCR鉴定，然后经Sanger测序检测突变类型。结果显示，靶位点的sgRNA寡核苷酸双链成功连入pT7-gRNA质粒中且序列正确；其中靶向ExonⅠ的313#位点的sgRNA可成功编辑斑马鱼hoxb4基因，T7EⅠ检测其敲除效率高达26.5%，并测序得到4种阳性突变型。通过CRISPR/Cas9系统成功编辑斑马鱼hoxb4基因并测序鉴定其突变类型，为HOXb4基因功能的研究提供了可靠的基因敲除方法。

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	舒莉萍	贵阳医学院组织工程与干细胞实验室	37	117	6.0	8.0
2	何志旭	贵阳医学院组织工程与干细胞实验室	73	246	8.0	12.0
3	袁梦	贵阳医学院组织工程与干细胞实验室	1	0	0.0	0.0
4	刘丰	贵阳医学院组织工程与干细胞实验室	1	0	0.0	0.0
5	李燕	贵阳医学院附属医院儿科学教研室	6	4	1.0	1.0