基于CRISPR/Cas9核糖核蛋白体DNA定点内切酶体外活性建立高效基因型分析技术

• 作者: 王南 祁显涛 刘昌林 谢传晓 朱金洁
• 来源期刊: 作物学报
• 关键词: sgRNA/Cas9核糖核蛋白复合体 Cas9NG 优化sgRNA (esgRNA) 基因型分析 突变体筛选
• 年，卷（期）: 2022,（7）
• 所属期刊栏目: 作物遗传育种·种质资源·分子遗传学
• 页码范围: 978-986
• 页数: 8页
• 语种: 中文
• DOI: 10.3724/SP.J.1006.2020.93064

摘要

建立快速、准确、高通量与简便易行的基因型分析技术对基因功能解析、分子育种与突变体鉴定研究具有重要价值。本研究的目标是利用Cas9或Cas9NG变体与单分子指导RNA (single guide RNA, sgRNA)核糖核蛋白复合体(sgRNA/Cas9-RNP或sgRNA/Cas9NG-RNP)体外DNA定点内切酶活性, 建立与优化简便高效与低成本的基因型分析技术。以我们前期创制的CRISPR/Cas9定点编辑玉米ZmWx基因第7外显子区域定点突变基因编辑后代分离群体为材料, 以ZmWx靶位点两侧特异引物扩增的PCR产物为底物, 利用原核表达并纯化的Cas9或Cas9-NG蛋白为DNA内切酶, 以体外转录的靶向ZmWx基因靶点的sgRNA或骨架序列优化的sgRNA (enhanced sgRNA, esgRNA)为Cas9或Cas9-NG酶定点活性指导元件, 通过体外组装为sgRNA/Cas9-RNP复合体, 对目标样本进行酶切, 以区分目标位点野生型、纯合突变体、杂合突变体基因型, 并对反应体系进行了优化。研究表明, 基于esgRNA/Cas9的PCR/RNP检测技术可对ZmWx基因编辑目标突变体后代进行快速有效的基因型鉴定; 实验体系优化结果表明, esgRNA/Cas9蛋白质量比为1∶1, 各为1 g, 20 L反应体系, 37℃酶切0.5 h, 可对500 ng待测DNA底物充分酶切并确定基因型; esgRNA/Cas9NG反应体系优化结果表明, 当esgRNA与Cas9-NG蛋白均为2 μg时, 37℃酶切4 h, 可对500 ng DNA底物进行酶切并实现基因型分析。利用Cas9NG拓宽靶位点检测范围的研究结果, 暗示Cas9NG是以牺牲核酸酶酶切活性为代价降低了Cas9蛋白对PAM (protospacer adjacent motif, PAM)基序NGG序列的依赖性, 实现PAM-NG基序识别能力, sgRNA/Cas9NG检测效率等仍有待提升与优化。本研究为基因功能解析、分子育种与突变体鉴定等研究提供了一套简便、成本低廉的技术方法, Cas9NG体外内切酶活性及其效率也为该Cas9突变体活体基因编辑技术研发提供了参考数据。