一个CRISPR/Cas9-VQR基因编辑系统的构建

• 作者: 陈凯 孙国梁 宋高原 李爱丽 谢传晓 毛龙 耿帅锋
• 来源期刊: 作物学报
• 关键词: CRISPR/Cas9-VQR 定点突变 PAM 基因突变
• 年，卷（期）: 2021,（6）
• 所属期刊栏目: 作物遗传育种·种质资源·分子遗传学
• 页码范围: 848-855
• 页数: 7页
• 语种: 中文
• DOI: 10.3724/SP.J.1006.2019.82052

摘要

CRISPR/Cas9系统是一种广泛应用于细菌、酵母、动物和植物中的基因组定点编辑技术，但该编辑系统的使用范围受PAM (proto-spacer-motif)位点NGG的限制。本研究通过突变Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9)编码氨基酸 (1135位的天冬氨酸D突变成缬氨酸V，1335位的精氨酸R突变为谷胱氨酸Q，1337位的苏氨酸T突变为精氨酸R，命名该突变子为Cas9-VQR)改造其识别PAM为NGA的位点以扩大其使用范围。并使用玉米Ubi启动子启动Cas9-VQR基因、优化SpCas9的密码子、加入保守的核定位信号序列、增加单子叶植物中保守的 3′ UTR 序列和使用水稻U6启动子启动gRNA来修饰该编辑系统。结果表明Cas9-VQR系统能够识别PAM为NGA的位点，并进行有效的切割。体外酶切活性检测结果表明Cas9-VQR的切割效率为5%~70%。水稻转化检测结果表明Cas9-VQR的切割效率约为27.5%~70.5%，平均切割效率为46.23%。本研究拓宽了CRISPR/Cas9系统在作物中的使用范围， 特别是NGA PAM位点较高的作物。