利用pHDE-Cas9构建巨桉CTX基因家族CRISPR载体

• 作者: 刘雅丽 尹爱国 布良灏 张婷婷 李莉梅 欧阳乐军 陈凯钊 陈自银
• 来源期刊: 南方农业学报
• 关键词: 巨桉 规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR) 细胞分裂素氧化酶/脱氢酶(CTX) 载体构建
• 年，卷（期）: 2018,（3）
• 所属期刊栏目: 作物遗传育种·种质资源·分子生物学
• 页码范围: 411-417
• 页数: 7页
• 分类号: S792.39
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.2095-1191.2018.03.01

摘要

[目的]利用高效基因编辑系统(pHDE-Cas9)构建巨桉细胞分裂素氧化酶/脱氢酶(CTX)基因家族规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR)载体,为开展巨桉CTX基因家族功能验证研究打下基础.[方法]设计巨桉CTX基因靶位点和引物,扩增pCBC质粒上的目的片段,BsaⅠ酶切pHDE载体并与目的片段连接形成重组质粒,转化DH5α感受态细胞.提取单克隆进行菌液PCR初步验证、重组质粒PCR验证,挑选阳性克隆质粒进行测序分析,构建CTX基因家族CRISPR载体.[结果]重组质粒PCR鉴定及测序结果表明,重组载体序列无突变,与预期序列高度一致.成功构建了巨桉CTX基因家族pHDE-CTXA、pHDE-CTXB和pHDE-CTXC同源表达载体.[结论]利用pHDE-Cas9成功构建了巨桉CTX基因家族CRISPR载体,构建过程快速、高效,为桉树基因组定点编辑打下了基础,也可为其他桉树CRISPR/Cas9表达载体的构建提供借鉴.