HDAC2磷酸化区域突变体的构建及其对小鼠成纤维细胞增殖的影响

• 作者: 徐祥 李向云 肖勇 袁培淞 邢伟 郭韡 黄宏
• 来源期刊: 重庆医学
• 学科: 生物学
• 关键词: HDAC2 Sumo-E3连接酶 磷酸化修饰 突变体构建 成纤维细胞
• 年，卷（期）: 2015,（13）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 1729-1731
• 页数: 3页
• 分类号: Q71|Q78
• 字数: 3261字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1671-8348.2015.13.001

摘要

目的 应用片段缺失突变技术鉴定HDAC2自身磷酸化对其Sumo-E3连接酶活性及蛋白质翻译的影响.方法 以前期获得的鼠源性HDAC2 Sumo-E3连接酶结构域基因片段为模板,设计片段缺失突变引物,经长片段重叠延伸PCR技术扩增获得片段缺失突变基因片段,后于Top10大肠杆菌中自然连接扩增获得pcDNA3.1/HDAC2-Sumo-E3连接酶磷酸化结构域缺失突变的真核表达载体.然后将载体转染于L929成纤维细胞瞬时过表达突变基因,再经翻译反应性荧光素酶报告基因实验和Western-blot鉴定HDAC2自身磷酸化修饰对Sumo-E3连接酶介导的报告基因和靶蛋白质表达的影响.最后通过MTT实验检测HDAC2自身磷酸化修饰对其Sumo-E3连接酶介导的L929细胞增殖的影响.结果 成功构建获得磷酸化修饰完全缺失的HDAC2片段缺失突变体pcDNA3.1/HDAC2-Sumo-E3(DEL 394-424AA).LUC报告基因检测结果显示,DEL 394-424AA片段缺失突变体促进LUC翻译是对照组的4.24倍,且能显著促进靶蛋白ODC和c-Myc的表达,以及L929小鼠成纤维细胞的增殖效应.结论 HDAC2自身磷酸化修饰对HDAC2 Sumo-E3连接酶活性及其调节的蛋白质翻译和细胞增殖作用起负性调节作用.