RNA可视化原位杂交技术对感染细胞中猪瘟病毒RNA定位与分布

• 作者: 孙永芳 宁宜宝 张乾义 张玉杰 徐璐 朱元源 王琴 赵启祖 赵燕 邹兴启 陈锴
• 来源期刊: 中国农业科学
• 关键词: 猪瘟病毒 定位 分布 RNA可视化原位杂交 荧光抗体试验(FAT)
• 年，卷（期）: 2016,（12）
• 所属期刊栏目: 畜牧?兽医?资源昆虫
• 页码范围: 2397-2407
• 页数: 11页
• 语种: 中文
• DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2016.12.015

摘要

【目的】为研究CSFV RNA在体外感染细胞中的分布及定位，建立了一种准确、敏感的RNA可视化原位杂交技术。【方法】本研究通过比对GenBank中公布的CSFV、BVDV和BDV全序列，避开BVDV和BDV的同源区，设计了CSFV RNA及内参基因β-actin的特异探针。以CSFV中等致病力毒株（HeBHH1/95）为参考毒株，在PK15细胞中培养病毒，加入RNA可视化原位杂交的特异探针和相应试剂，采用荧光共聚焦显微镜进行成像观察。通过综合分析观测结果、荧光强度、重复性等因素，采用正交试验优化了对原位杂交过程中具有重要影响的蛋白酶K浓度和甲醛固定时间，建立了CSFV RNA可视化原位杂交技术，并与FAT方法比较该技术灵敏度；用我国目前流行的CSFV 1.1、2.1、2.2、2.3基因亚型及BVDV、PPV、PRV和PCV-2病毒进行特异性试验。最终，以CSFV强致病力毒株（SM）接种PK15细胞，病毒感染后0.5、1、3、6、8、10、14、18、24、36、48、72、96h(hours post inoculation， hpi)取样，每个时间点2个重复，采用CSFV RNA可视化原位杂交技术进行检测。为佐证病毒蛋白在细胞中的定位及分布，同时采用FAT方法对SM株E2蛋白在PK15细胞中的表达情况进行动态研究。【结果】采用该技术在荧光共聚焦显微镜下可观察到CSFV RNA在细胞中的定位；当蛋白酶K浓度为1：1000、甲醛固定时间为30min时为最优反应条件；灵敏度试验表明该技术对病毒的检测极限为10-8/200μL，比FAT高3.5个数量级；特异性试验结果显示该探针能与CSFV 1.1、2.1、2.2、2.3亚型结合，与BVDV、PPV、PCV-2、PRV无交叉反应。采用该技术对CSFV RNA感染后在靶细胞中的定位与分布研究结果显示：0.5hpi在胞核和胞浆均能检测到RNA，0.5—6hpi RNA主要分布于胞核内并在核内富集；10hpi胞浆内RNA逐渐增多，胞核内RNA逐渐减少，24hpi RNA主要集中在胞浆内细胞核周围；36hpi核外RNA大量聚集增多，72hpi达到峰值；96hpi RNA总量有所下降。而FAT结果显示：8hpi在少数细胞的胞浆内检测到病毒E2蛋白，10—24hpi蛋白表达数量一直较少；36hpi蛋白表达量不断增多，72hpi达到最大值；96hpi荧光信号由强变弱。病毒蛋白在细胞浆内的聚集数量与细胞浆中RNA含量成正相关。【结论】首次建立了CSFV RNA可视化原位杂交检测技术，并对CSFV强致病力毒株在细胞中的RNA定位分布进行了研究，发现病毒RNA吸附和进入靶细胞的时间早于0.5hpi，观察到CSFV RNA有在细胞核内的生活史。