链格孢菌苹果致病型的 ATMT 转化体系的建立

• 作者: 施文骁 王洪凯 郭庆元 顾雪迎
• 来源期刊: 中国农业科学
• 关键词: 链格孢菌 苹果致病型 农杆菌介导的转化 致病性
• 年，卷（期）: 2016,（10）
• 所属期刊栏目: 植物保护
• 页码范围: 1885-1891
• 页数: 7页
• 语种: 中文
• DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2016.10.005

摘要

【目的】链格孢菌（Alternaria alternate）苹果致病型是苹果上的重要致病菌，可以侵染苹果叶片和果实。论文旨在建立农杆菌介导的链格孢菌苹果致病型高效稳定的分子转化体系，为在分子水平上研究链格孢苹果致病型病菌的致病机制提供技术支持。【方法】质粒 pKO1-HPH 是以 pCAMBIA1300骨架为基础构建的穿梭质粒，含有潮霉素抗性基因，并在其多克隆位点上插入了绿色荧光蛋白基因，这个质粒在大肠杆菌和农杆菌细胞中都能够稳定地复制繁殖。将质粒 pKO1-HPH 采用冻融法转化到农杆菌菌株 AGL1中，然后与链格孢苹果致病型菌株 XP-1的分生孢子在诱导培养基上共培养进行基因转化，转化子在含有潮霉素的马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基上进行筛选；在含有50μg·mL-1潮霉素的马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基上检测转化子细胞中抗性基因在转化子中的表达情况；用荧光显微镜检测绿色荧光蛋白基因在转化子细胞中的表达情况。在初步确认可以将绿色荧光蛋白和潮霉素 B 磷酸转移酶基因转入链格孢苹果致病型菌株中后，对菌落培养时间、转化前分生孢子的预处理方法对转化效率的影响进一步优化。转化子的稳定性采用分生孢子5次继代培养后，能否在含有潮霉素的马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基上稳定生长来检测；采用 PCR 方法检测绿色荧光蛋白外源基因和潮霉素 B 磷酸转移酶基因是否存在于转化子基因组中；用 Southern 杂交检测外源基因在转化子基因组中插入的拷贝数；在苹果果实和叶片上接种检测转化子致病性的变化。【结果】将100μL 孢子悬浮液（含105孢子）涂布于马铃薯-胡萝卜-琼脂平板上菌落培养36—48 h 后，链格孢苹果致病型菌株 XP-1可以产生足量的孢子用于农杆菌介导的分子转化。将分生孢子用无菌水洗下，在4℃处理6 h，再与含质粒 pKO1-HPH 的农杆菌进行诱导共培养，转化子在含有50μg·mL-1潮霉素的马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基上进行筛选，转化效率较好，107个分生孢子转化可获得约200个转化子。转化子经过5次继代培养，对潮霉素 B 的抗性没有改变。特异性引物 PCR 检测表明外源基因能够成功地整合到供试菌株的基因组中；Southern杂交表明外源基因多以单拷贝形式随机插入到链格孢苹果致病型菌株 XP-1细胞的基因组中；转化子的菌丝和分生孢子在荧光显微镜下可以观察到明显的绿色荧光，说明荧光蛋白基因在菌丝及孢子中均能够成功表达。通过部分转化子的致病性试验，筛选获得数个在苹果果实和叶片上致病性都显著降低的菌株。【结论】建立了农杆菌介导的链格孢菌苹果致病型稳定高效的分子转化体系，为进一步开展此病菌与其寄主的分子互作研究打下基础。

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	王洪凯	浙江大学生物技术研究所	26	577	12.0	24.0
2	郭庆元	新疆农业大学农学院	56	379	11.0	15.0
3	施文骁	浙江大学生物技术研究所	4	8	2.0	2.0
4	顾雪迎	新疆农业大学农学院	3	12	2.0	3.0