携带EGFP基因的戊型肝炎病毒重组质粒的构建及其感染性的验证

• 作者: 井申荣 姜典财 彭福春 李云龙 杨臣臣 毕艳红 王珏 禹文海 龙飞燕
• 来源期刊: 病毒学报
• 学科: 医学
• 关键词: 戊型肝炎病毒(HEV) 增强型绿色荧光蛋白(EGFP) 感染性
• 年，卷（期）: 2016,（5）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 529-537
• 页数: 9页
• 分类号: R373.2
• 语种: 中文

摘要

为了构建携带增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因的戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)重组质粒,转染人肺癌细胞A549细胞验证其感染性,PCR法分两段扩增HEV全基因组序列和EGFP基因序列,将EGFP报告基因插入到HEV ORF2基因下游,并克隆到体外转录表达载体pGEM(@)-7Zf(+)上.然后利用脂质体转染法将重组质粒转入A549细胞,24 h后在荧光显微镜下观察EGFP的表达;转染72 h后,利用免疫荧光法检测HEV ORF2蛋白的表达.转染7d后将发生病变的A549细胞收集作为接种物,接种A549细胞验证携带EGFP的HEV-EGFP重组病毒的感染性.结果显示经酶切和测序鉴定携带EGFP的HEV重组表达质粒pGEM-HEV-EGFP构建成功;EGFP基因与HEV在A549细胞中可融合表达;携带EGFP的HEV重组表达质粒转染A549细胞7d后出现病变,并且连续传代3代仍具有感染性.本研究成功构建了携带EGFP的HEV全基因组重组质粒pGEM-HEV-EGFP,并成功感染A549细胞,为进一步研究HEV的复制机制及致病机理奠定基础.