携带 CIP2A shRNA 重组腺相关病毒载体的构建及其鉴定

• 作者: 刘青光 孙昊 宋涛 杨威 杨雪 陶杰
• 来源期刊: 西安交通大学学报（医学版）
• 关键词: CIP2A RNA 干扰 重组腺相关病毒 短发卡 RNA
• 年，卷（期）: 2015,（6）
• 所属期刊栏目: 基础研究
• 页码范围: 743-748
• 页数: 6页
• 分类号: R737.9
• 语种: 中文
• DOI: 10.7652/jdyxb201506006

摘要

目的：构建携带 CIP2A shRNA 重组腺相关病毒载体,制备靶向性沉默 CIP2A 表达的高浓度重组腺相关病毒。方法设计合成 CIP2A shRNA,退火形成双链与 pDC316-EGFP-U6质粒 BamHⅠ和 HindⅢ双酶切产物相连接构建形成质粒 pDC316-EGFP-CIP2A shRNA,以鉴定正确的 pDC316-EGFP-CIP2A shRNA 克隆为模板 PCR 扩增 EGFP-CIP2A shRNA 片段,EcoRⅠ和 SalⅠ双酶切 PCR 扩增产物及 pSNAV2.0质粒后进行连接形成重组质粒 pSNAV2.0-EGFP-CIP2A shRNA,建立载体细胞株 BHK/CIP2A-shRNA,采用 AAV MaxTM 包装系统大规模制备 rAAV2-EGFP-CIP2A shRNA 并对其纯化及滴度测定。将 rAAV2-EGFP-CIP2A shRNA 感染肝癌细胞 HepG2,利用空载病毒载体rAAV2-EGFP 作对照,采用 Real-time PCR 及 Western blot 方法检测 CIP2A shRNA 基因沉默效果。结果携带编码CIP2A shRNA 腺相关病毒载体质粒 pSNAV2.0-EGFP-CIP2A shRNA 经双酶切及测序鉴定,质粒构建正确；将重组质粒与辅助病毒 HSV1-rc/ΔUL2共转染包装细胞 BHK-21,成功制备重组腺相关病毒 rAAV2-CIP2A shRNA,经测定纯化所得 rAVV2病毒滴度为0.25×1012 v.g./mL。筛选 MOI 值为1×105感染肝癌细胞 HepG2,CIP2A mRNA 及蛋白表达水平分别于感染后24 h 和48 h 与对照细胞相比出现明显下降。结论成功制备高滴度携带 CIP2A shRNA重组腺相关病毒载体 rAAV2-CIP2A shRNA。

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	刘青光	西安交通大学医学部第一附属医院肝胆外科	155	1133	18.0	22.0
2	杨威	西安交通大学医学部第一附属医院肝胆外科	58	290	10.0	13.0
3	陶杰	西安交通大学医学部第一附属医院肝胆外科	27	85	6.0	7.0
4	杨雪	西安交通大学医学部第一附属医院肝胆外科	34	220	7.0	13.0
5	宋涛	西安交通大学医学部第一附属医院肝胆外科	91	380	12.0	17.0
6	孙昊	西安交通大学医学部第一附属医院肝胆外科	40	342	10.0	17.0