针对Fbxl5基因关键结构域F-box的Crispr/Cas9打靶有效性分析

• 作者: 万永奇 傅雪珂 吴秀山 尹丽阳 李永青 邓云 陈宇 高建芳 高晶
• 来源期刊: 激光生物学报
• 学科: 生物学
• 关键词: Fbxl5 F-box基因家族 CRISPR/Cas9 基因敲除
• 年，卷（期）: 2016,（6）
• 所属期刊栏目: 基础研究
• 页码范围: 559-563
• 页数: 5页
• 分类号: Q78
• 字数: 2767字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1007-7146.2016.06.012

摘要

为了在动物体内研究Fbxl5基因是通过什么机制导致斑马鱼心脏出现突变表型,本文利用近几年兴起的CRISPR/Cas9打靶技术建立斑马鱼Fbxl5基因敲除品系.本文将打靶位点定位于Fbxl5的F-box结构域,也就是FbxN的第五号外显子上.首先经过基因打靶网站分析筛选出针对Fbxl5基因F-box结构域最适合的打靶位点,扩增出Fbxl5基因CRISPR/Cas9打靶双链DNA,并转录为RNA,与Hcas9共注射至斑马鱼胚胎.最后,在注射48 h后对Fbxl5基因CRISPR/Cas9打靶的有效性进行检测.首先在注射48 h之后收集胚胎提取基因组DNA,用特异性引物进行PCR扩增;将纯化后的Fbxl5基因PCR产物连接到pMD18-T载体,再经质粒提取,测序分析,通过与WT斑马鱼基因组序列进行比对发现Fbxl5-9号在PAM序列AGG下游缺失了4个碱基.证明该CRISPR/Cas9系统在敲除心脏发育候选基因Fbxl5是有效的,该研究为最终获得Fbxl5基因敲除斑马鱼奠定了良好的基础.