绵羊MITF-M在黑素细胞中过表达后的功能分析

• 作者: 张丹瑾 杨玉静 聂瑞强 范瑞文 董常生 谢建山 高文俊
• 来源期刊: 中国农业科学
• 关键词: 小眼畸形相关转录因子(MITF) TYR TYRP-1 TYRP-2
• 年，卷（期）: 2016,（21）
• 所属期刊栏目: 畜牧·兽医·资源昆虫
• 页码范围: 4214-4221
• 语种: 中文
• DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2016.21.015

摘要

[目的]小眼畸形相关转录因子-M型(microphthalmia associated transcription factor M,MITF-M)在动物皮肤和毛发的黑色素合成途径中发挥重要作用,克隆绵羊小眼畸形相关转录因子-M型基因序列,研究在绵羊黑素细胞中过表达绵羊MITF-M是否影响TYR、TYRP-1和TYRP-2的表达,从而探究对黑色素的生成的影响.[方法]使用试验室冻存的第5代绵羊黑素细胞,通过PCR方法用引物以绵羊黑素细胞cDNA为模板克隆MITF-M基因cDNA序列,构建绵羊MITF-M克隆载体和真核表达载体;通过细胞转染技术在细胞水平过量表达绵羊MITF-M;转染后使用荧光显微镜观察细胞转染效率,采用分光光度计对绵羊黑素细胞中黑色素含量进行测定,并进行Real-time PCR试验检测转染后细胞MITF、TYR、TYRP-1和TYRP-2基因在mRNA水平表达量的变化,Western blot试验检测转染后细胞MITF、TYR蛋白水平的变化.[结果]经测序和拼接,最终获得长度为1 242 bp的绵羊MITF-M基因的cDNA序列;成功构建真核表达载体,载体上连有一个启动报告基因绿色荧光蛋白和特异性TYRP-2基因启动子;细胞转染后,在荧光显微镜下可观察到黑素细胞带有绿色荧光说明转染效率明显;分光光度计检测显示,转染后绵羊黑素细胞中黑色素量增加1.15倍(P＜0.05);荧光定量检测结果显示,绵羊黑素细胞中MITF mRNA表达量增加极显著(P＜0.001),表明绵羊MITF-M转染效率显著,TYR mRNA表达量增加极显著(P＜0.001),TYRP-1 mRNA表达量升高至5.06倍(P＜0.05),TYRP-2 mRNA表达量升高至1.49倍,变化不明显.蛋白免疫印迹结果显示,绵羊黑素细胞中MITF-M转染组MITF蛋白表达量是空载体组的1.65倍(P＜0.001),转染组TYR蛋白表达量是空载体组的2.38倍(P＜0.001),这与荧光定量检测结果一致.[结论]通过PCR和克隆技术及核酸测序技术获得了绵羊MITF-M基因全长1 242 bp的CDS区,过表达绵羊MITF-M会使黑素细胞TYR、TYRP-1的表达量增加,对TYRP-2的表达量变化不明显,从而揭示绵羊MITF-M可以通过调节TYR和TYRP-1的表达量控制绵羊黑素细胞中黑色素的生成.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	范瑞文	山西农业大学动物科技学院	100	437	10.0	16.0
2	董常生	山西农业大学动物科技学院	152	794	13.0	20.0
3	高文俊	山西农业大学动物科技学院	45	431	11.0	19.0
4	谢建山	山西农业大学动物科技学院	16	71	5.0	8.0
6	杨玉静	山西农业大学动物科技学院	9	25	3.0	4.0
7	聂瑞强	山西农业大学动物科技学院	7	25	3.0	4.0
10	张丹瑾	山西医科大学晋祠学院	1	10	1.0	1.0