氧化应激活化RAW264.7巨噬细胞对MC3T3-E1成骨细胞迁移、增殖及成骨基因表达影响的实验研究

• 作者: 彭建强 易志新 李亮平 林昆 武明鑫 罗嘉全 靳松 黄爱军 黄胜
• 来源期刊: 中国修复重建外科杂志
• 关键词: 氧化应激 H2O2 MC3T3-E1细胞 RAW264.7细胞 成骨分化
• 年，卷（期）: 2016,（9）
• 所属期刊栏目: 干细胞与组织工程
• 页码范围: 1146-1152
• 页数: 7页
• 语种: 中文
• DOI: 10.7507/1002-1892.20160234

摘要

目的 探索氧化应激活化RAW264.7巨噬细胞对MC3T3-E1成骨细胞迁移、增殖及成骨基因表达的影响.方法 取MC3T3-E1细胞系及RAW264.7细胞系,分别培养传至第7代进行实验.利用不同浓度(0、25、50、100 μmol/L)H2O2刺激RAW264.7细胞,MTS检测培养1、3、6h后细胞增殖率,采用超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)检测试剂盒检测培养1h时细胞内SOD含量,筛选H2O2引起RAW264.7细胞氧化应激的最佳浓度和作用时间,并对应收集RAW264.7细胞(加或不加H2O2处理)24h上清液.取第7代MC3T3-E1细胞,分别以100μL无血清DMEM培养基(A组)、未氧化应激RAW264.7细胞上清液(B组)、氧化应激RAW264.7细胞上清液(C组)培养,采用MTS法检测细胞增殖情况,行划痕实验检测细胞迁移能力;另取细胞分为4组,空白对照组,以完全培养基培养;阳性对照组,以含50μg/mL维生素C及10 nmol/L的β甘油磷酸钠的完全培养基进行成骨诱导培养;正常对照组,以含50 μg/mL维生素C及10 nmol/L的β甘油磷酸钠的完全培养基及未氧化应激RAW264.7细胞上清液培养;实验组,以含50 μg/mL维生素C及10 nmol/L的β甘油磷酸钠的完全培养基及氧化应激RAW264.7细胞上清液培养.培养3、7、14d,RT-PCR检测细胞内成骨相关基因ALP、Runx2、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)、Ⅰ型胶原蛋白(collagen type Ⅰ,COL-Ⅰ)、骨钙素(osteocalcin,oc)、骨唾液酸蛋白(bone sialoprotein,BSP)表达水平.结果 MTS和SOD检测结果显示:25 μmol/L H2O2刺激1h为构建RAW264.7细胞氧化应激模型最佳浓度和作用时间.细胞生长检测显示:1、2、3dB、C组细胞增殖率显著高于A组(P＜0.05),C组低于B组,其中2、3d时组间比较差异有统计学意义(P＜0.05).划痕实验显示12 h时B、C组MC3T3-E1细胞迁移显著快于A组,C组快于B组,细胞迁移距离比较差异有统计学意义(P＜0.05);24 h时B、C组划痕已被细胞爬满.除3d外,实验组各时间点ALP、Runx2、OC、BSP mRNA相对表达量均较阳性对照组明显降低,OPN、COL-Ⅰ mRNA相对表达量较空白对照组降低,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 H2O2构建RAW264.7细胞氧化应激模型的最佳浓度为25μmol/L、作用时间为1h.氧化应激活化RAW264.7巨噬细胞上清液能促进MC3T3-E1成骨细胞迁移、抑制其增殖及成骨相关基因的表达.