不同来源β-酪蛋白基因启动子调控人IFNα-2b基因的表达效率

• 作者: 刘庆友 李辉 石德顺
• 来源期刊: 中国农业科学
• 关键词: 启动子 娟姗牛 干扰素α-2b Bcap-37 转基因
• 年，卷（期）: 2016,（5）
• 所属期刊栏目: 畜牧·兽医·资源昆虫
• 页码范围: 970-978
• 语种: 中文
• DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2016.05.017

摘要

[目的]为获得高启动效率的乳腺特异启动子,对荷斯坦奶牛、娟姗牛和奶水牛的β-酪蛋白基因启动子进行比较研究.[方法]对Genbank中所收录的荷斯坦奶牛、娟姗牛和水牛β-酪蛋白基因启动子序列进行比对分析,按照保守序列分别设计启动子区和3'端ployA序列引物,同时设计人IFNα-2b基因和EGFP-Neo筛选序列引物并引入预先设计的酶切位点以方便载体构建.采集静脉血液,提取基因组DNA.PCR克隆β-酪蛋白基因启动子区和3'端ployA区,同时以实验室保存质粒为模板克隆人IFNα-2b基因和EGFP-Neo筛选序列.测序正确后,将各片段按设计顺序依次插入pMD18-T骨架中,构建成pHSTBCNp-IFN,pJSBCNp-IFN和pSNBCNp-IFN乳腺特异表达载体.将各载体转染Bcap-37细胞,经G418筛选出稳定整合的转基因细胞系.用胰岛素(1 mg·L-1),转铁蛋白因子(1 mg·L-1),氢化可的松(1 mg·L-1)和PRL (250IU·L-1)联合对转基因细胞系进行诱导,然后用PCR、Western blotting、QRT-PCR技术和ELISA方法分别在mRNA水平和蛋白质水平检测IFN α-2b的表达.[结果]PCR后获得了荷斯坦奶牛、娟姗牛和水牛β-酪蛋白基因启动子区,长度分别为5 219、5 244和5 216 bp,其中包括了第一外显子,第一内含子和部分第二外显子,部分第二外显子的51个碱基编码17个氨基酸的信号肽序列.克隆了1 166 bp的ployA区序列.最终将构建的3个乳腺特异表达载体转染Bcap-37细胞并经过G418筛选后,获得了3个转基因细胞系.经激素诱导后,PCR、Western blotting、QRT-PCR和ELISA检测发现3个转基因细胞系都表达了IFN α-2b基因,并且发现娟姗牛β-酪蛋白基因启动子在调控IFN α-2b基因的表达上效率较高,在mRNA水平和蛋白质水平上显著高于其他两个启动子(P＜0.05).[结论]娟姗牛β-酪蛋白基因启动子在调控外源基因表达上具有较高的效率,是具有应用前景的乳腺特异性启动子.所构建的表达载体为IFN α-2b转基因动物乳腺生物反应器的制备奠定基础.