稻曲病菌T-DNA插入突变菌株B1241侧翼基因克隆

• 作者: 丁慧 于俊杰 俞咪娜 刘永锋 尹小乐 王亚会 薄惠文
• 来源期刊: 中国农业科学
• 关键词: 稻曲病菌 T-DNA 致病力 糖基水解酶18家族 基因克隆
• 年，卷（期）: 2016,（9）
• 所属期刊栏目: 植物保护
• 页码范围: 1685-1695
• 语种: 中文
• DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2016.09.005

摘要

[目的]分析稻曲病菌(Ustilaginoidea virens)致病力减弱的T-DNA插入突变菌株B1241的生物学性状和致病力,并结合分子生物学手段研究其T-DNA插入位点的侧翼基因,以解析突变基因在稻曲病菌生长和致病过程中的作用,从而为阐明稻曲病菌致病机制提供理论基础.[方法]以野生菌株P1作为对照,观察并检测突变菌株B1241的菌落形态、生长速率、孢子形态、产孢量等生物学性状;采用注射接种的方法将菌丝和孢子的混合液接种于水稻穗苞中,统计每穗发病的病粒数,分析B1241的致病性变化;突变菌株B1241在不合有潮霉素的PSA平板上转接5代之后,PCR检测T-DNA插入的稳定性并通过Southern杂交分析B1241中T-DNA插入的拷贝数;利用HiTail-PCR获得T-DNA插入位点的侧翼序列,经NCBI比对得到侧翼基因;运用RACE-PCR克隆插入位点侧翼基因全长;qRT-PCR分析侧翼基因的表达情况.[结果]经生物学特性观察及田间接种发现,与野生菌株P1相比,突变菌株B1241在固体培养基MM、PSA和TB3上的菌落和孢子形态以及生长速率无显著差异,其致病力、产孢能力均呈极显著下降.B1241在不合潮霉素的PSA平板上转接5代之后,仍能扩增到GFP和HPH基因,说明T-DNA已经稳定地插入到其基因组中.Southern杂交结果显示T-DNA在该突变菌株中以单拷贝的形式插入.经扩增并比对侧翼序列,T-DNA的插入位点处少了28 bp的稻曲序列,有37 bp在T-DNA及稻曲病菌基因组中都没有比对到.NCBI比对发现,侧翼基因Uvt-1241与UV-8b菌株的UV8b-7878基因同源,开放阅读框长2 317 bp,包含81和106 bp的2个内含子,编码709个氨基酸.经RACE-PCR获得基因全长2 650 bp,5’非编码区长度为14 bp,3’非编码区长度为319 bp. T-DNA插入在基因Uvt-1241的启动子区域,位于起始密码子之前516 bp处.qRT-PCR分析结果表明,Uvt-1241在该突变体中表达量下降.该基因编码一个糖基水解酶18家族的蛋白,同时含有一个保守结构域D× ×D×D×E.[结论]稻曲病菌突变菌株B1241中,T-DNA插入到基因Uvt-1241的启动子区域,从而导致该启动子功能部分缺失,基因表达量下降,使得突变菌株的生长、产孢等生物学特性及致病力发生改变,由此推测该基因可能在稻曲病菌生长及致病过程中起着重要的作用.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	刘永锋		116	2469	28.0	44.0
2	于俊杰	江苏省农业科学院植物保护研究所	24	249	12.0	14.0
3	尹小乐	江苏省农业科学院植物保护研究所	20	233	12.0	14.0
4	俞咪娜	江苏省农业科学院植物保护研究所	17	164	9.0	12.0
5	王亚会	江苏省农业科学院植物保护研究所	2	8	2.0	2.0
6	薄惠文	江苏省农业科学院植物保护研究所	1	4	1.0	1.0
10	丁慧	江苏省农业科学院植物保护研究所	1	4	1.0	1.0