快速分离和鉴别转基因单克隆细胞的改良方法

• 作者: 周晓娜 张丽娜 张正银 李新娜 杜鹃 汪晶冰 王亚婷 赵溶冰 郭芳
• 来源期刊: 中国优生与遗传杂志
• 学科: 医学
• 关键词: 饲养细胞 单克隆 培养上清 荧光素酶报告实验 丝裂霉素C
• 年，卷（期）: 2016,（4）
• 所属期刊栏目: 分子遗传学与生化遗传学
• 页码范围: 36-39,封3
• 页数: 5页
• 分类号: R394.3
• 语种: 中文

摘要

目的 探索快速有效的从稳定转染后的悬浮多克隆细胞中分离、纯化并鉴定出单克隆的技术改良法.方法 电穿孔法稳定转染后的T淋巴细胞系先在分离培养基中扩增成多克隆,用有限稀释法分离出单个细胞,一部分用丝裂霉素C处理的饲养细胞培养扩增单克隆,一部分进行无饲养细胞扩增,用未转染的T淋巴细胞系的新鲜培养上清换液,对比两法的单克隆得率.检测单克隆的靶基因整合则先用荧光素酶报告实验再结合引物PCR扩增法,筛选出表达标记蛋白并整合有完整特异基因片段的单克隆.结果 两种方法在分离培养基中存活增殖的活细胞克隆数量比例分别为5.27％和4.55％,无显著差异,通过荧光素酶报告基因实验确定完整整合外源基因的靶克隆比率(0.80％和0.57％)也无显著差异.单克隆的报告荧光素酶表达强度显著高于多克隆和对照,比较直观快速.结论 无饲养细胞法避免了饲养细胞复燃污染单克隆细胞,简化了步骤提高了效率,能保证单个细胞在选择培养基中成功扩增出单克隆.荧光素酶报告基因实验能快速、有效检测出外源整合基因的表达.