人C-Src蛋白酪氨酸激酶真核表达、纯化及活性检测

• 作者: 徐岚 李晓荣 肖斌 郝文波 陈慧芹
• 来源期刊: 生物技术通报
• 关键词: Csk基因 293T细胞 真核表达 纯化 活性鉴定
• 年，卷（期）: 2016,（5）
• 所属期刊栏目: 研究报告
• 页码范围: 75-81
• 页数: 7页
• 语种: 中文
• DOI: 10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.05.010

摘要

旨在构建人C-Src蛋白酪氨酸激酶（Csk）基因真核表达系统。从HeLa细胞中提取总的RNA，通过RT-PCR获得Csk基因全长cDNA序列，并将其克隆至真核表达载体pENTER中，构建重组质粒pENTER-Csk-his。重组质粒转染293T细胞48 h后通过SDS-PAGE、Western blot检测Csk蛋白表达情况，间接免疫荧光进行蛋白定位，通过镍螯合的磁珠法纯化Csk蛋白，his-pulldown及CO-IP检测表达蛋白的活性。结果显示，经双酶切及测序鉴定，真核表达载体pENTER-Csk-his正确没有突变，SDS-PAGE及Western blot均可检测到大小约为51 kD的目的蛋白，说明Csk蛋白在293T细胞中表达成功，间接免疫荧光定位重组Csk蛋白在细胞质中表达，通过磁珠纯化得到Csk蛋白，最后通过his-pulldown及CO-IP发现Csk能够与IGF1R、SHC1相互作用，说明表达的Csk蛋白具有生物学活性。成功获得Csk基因全长序列，并构建重组pENTER-Csk-his真核表达质粒，在真核细胞293T的细胞质中获得高效表达且表达的蛋白具有生物学活性。

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	郝文波	南方医科大学抗体工程研究所	44	69	4.0	5.0
2	肖斌	南方医科大学抗体工程研究所	7	39	3.0	6.0
3	徐岚	南方医科大学抗体工程研究所	4	1	1.0	1.0
4	陈慧芹	南方医科大学抗体工程研究所	3	6	1.0	2.0
5	李晓荣	南方医科大学抗体工程研究所	1	1	1.0	1.0