新现猪Delta冠状病毒RT-PCR检测方法的建立及其应用

• 作者: 何后军 吴琼 周信荣 唐玉新 宋德平 张帆帆 彭棋 李安琪 陈燕君 黄冬艳
• 来源期刊: 中国农业科学
• 关键词: 猪Delta冠状病毒 RT-PCR 腹泻 进化树 应用
• 年，卷（期）: 2016,（7）
• 所属期刊栏目: 畜牧?兽医?资源昆虫
• 页码范围: 190-198
• 页数: 9页
• 语种: 中文
• DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2016.07.016

摘要

【目的】猪Delta冠状病毒（Porcine Deltacoronavirus, PDCoV）是近年来新发现的可引起猪只，特别是新生仔猪腹泻的冠状病毒，其引发的腹泻具有较高的发病率和死亡率，是造成新生仔猪死亡的重要原因之一。试验拟建立新现PDCoV RT-PCR检测方法，并调查当前江西腹泻猪群中PDCoV的感染情况。【方法】通过对GenBank数据库中PDCoV全基因组序列的比对分析，找出保守序列，用Primer 3.0在线软件设计1对扩增PDCoV核衣壳（N）蛋白基因片段的特异性引物，基于该引物建立PDCoV RT-PCR检测方法；用建立的方法检测腹泻猪粪便及肠道样品，挑选阳性扩增产物进行克隆、测序；用本试验获得的PDCoV序列与其他国家或地区的PDCoV序列以及猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）共同构建进化树，分析PDCoV各毒株及其与PEDV和TGEV之间的进化关系；以PEDV、TGEV、猪库布病毒（PKoV）、猪星状病毒（PAstV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）及猪瘟病毒（CSFV）RNA 为模板验证引物的特异性；构建 PDCoV 核衣壳蛋白基因片段重组质粒，并以系列稀释的重组质粒为模板确定所建立的 PDCoV RT-PCR 方法的敏感性；应用建立的 RT-PCR 方法调查249份2012—2015年江西省猪群腹泻样品中PDCoV的存在情况，随机抽取一定数量的RT-PCR阳性扩增产物进行克隆、测序进一步验证反应的特异性。【结果】①以腹泻猪粪便样品RNA为模板，应用所设计的特异性引物扩增出了329 bp的单一条带，与预期目的片段大小一致，扩增产物经克隆后测序，将获得的序列与NCBI GenBank数据库序列进行比对，比对结果表明试验所获得的序列与数据库中PDCoV序列的同源性高达99.1%，证明所扩增的序列属于PDCoV；②将8条本试验获得的PDCoV N基因片段序列与18株其他国家或地区的PDCoV毒株以及PEDV、TGEV的相应N基因片段序列构建进化树，结果表明26条PDCoV序列属于同一个分支，而PEDV和TGEV则分别属于不同的分支。试验获得的PDCoV序列与韩国PDCoV毒株KNU14-04亲缘关系最近，同源性高达99.1%；与两株香港毒株HKU 15-44和HKU 15-155亲缘关系相对较远；③本试验建立的RT-PCR方法特异性强，仅能扩增出PDCoV，而对PEDV、TGEV、PKoV、PAstV、PRRSV及CSFV核酸无交叉扩增现象；④所建立的RT-PCR方法灵敏度高，将含扩增片段的重组质粒以1.0×106拷贝/μL为起始浓度依次10倍稀释至1.0×101拷贝/μL作为模板验证方法的灵敏度，结果表明所建立的方法对 PDCoV 最低可检出量为1.0×103拷贝/μL；⑤应用建立的 RT-PCR 方法检测了249份2012—2015年采集自江西省各地区的腹泻母猪粪便及腹泻仔猪粪便/肠道样本，结果显示腹泻样本中 PDCoV 的检出率为31.33%（78/249），母猪粪便中PDCoV的检出率（27.78%）稍低于仔猪粪便及肠道样品PDCoV的检出率（31.92%），最早可从2012年的样品中检测出PDCoV。【结论】试验成功建立了检测新现PDCoV的RT-PCR方法；应用所建立的RT-PCR方法检测了249份2012—2015年江西地区猪群临床腹泻样品中PDCoV存在情况，结果表明PDCoV是一种普遍存在于腹泻猪群中的病毒；研究建立的RT-PCR方法对猪群PDCoV的临床诊断和流行病学调查等具有应用价值。