猪δ冠状病毒SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用

• 作者: 兰培英 张云飞 张利卫 张君涛 曹贝贝 胡慧 韦学雷
• 来源期刊: 农业生物技术学报
• 学科: 农学
• 关键词: 猪δ冠状病毒(PDCoV) M基因 SYBR Green Ⅰ qRT-PCR
• 年，卷（期）: 2017,（6）
• 所属期刊栏目: 研究资源与技术改进
• 页码范围: 969-975
• 页数: 7页
• 分类号: S855.3
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1674-7968.2017.06.011

摘要

猪δ冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)是一种新的引起仔猪腹泻的冠状病毒,2014年以来在我国各省开始流行,建立一种快速、准确的检测方法对于该病流行病学、致病机制的研究具有重要的意义.根据GenBank中公布的PDCoVM基因序列设计一对特异性引物,扩增M基因的特异性片段,构建pMD 18-T-PDCoV-M重组质粒,以此为模板,SYBR Premix Ex Taq为荧光染料,通过对荧光定量RT-PCR(reverse transcription-PCR)扩增条件的优化,建立了针对PDCoV的荧光定量RT-PCR检测方法,并对所建立方法的特异性、灵敏性和稳定性进行了研究.结果显示,所建立的方法具有高度敏感性,最低检测限为54拷贝/μL;应用该方法对猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus of swine,TGEV)、猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)和猪繁殖与呼吸综合症病毒(Porcine respiratory and reproductive syndrome virus,PRRSV)等其他常见猪病毒性病原检测均为阴性,表明所建立的方法具有较好的特异性;且具有较好的重复性,组内和组间变异系数均小于1％.对临床198份腹泻样品进行检测,阳性率为20.71％(41/198).实验所建立的SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR方法能快速、准确检测新发PDCoV,为该病的深入研究提供了新的技术手段.