新型阿卡斑病毒SYBR Green I荧光定量RT-PCR建立及广西边境地区蚊携带新型阿卡斑病毒调查

• 作者: 马玲 孟菲 陆晨阳 陈赫威 蔡畅 秦树英 覃绍敏 刘金凤 陈凤莲 吴健敏
• 来源期刊: 南方农业学报
• 关键词: 新型阿卡斑病毒（AKAV） 蚊媒病毒 SYBR Green I荧光定量RT-PCR 广西边境地区
• 年，卷（期）: 2022,（6）
• 所属期刊栏目: 畜牧·兽医·水产·蚕桑
• 页码范围: 1734-1741
• 页数: 7页
• 分类号: S852.659.5
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.2095-1191.2022.06.027

摘要

【目的】建立检测新型阿卡斑病毒（AKAV）的SYBR Green I荧光定量RT-PCR，并结合序列测定开展广西边境地区蚊携带新型AKAV调查，了解其流行趋势及遗传进化特征，为建立重要蚊媒病毒病预警机制提供技术支持。【方法】分别针对新型AKAV的S基因和M基因主要变异位点设计引物，建立SYBR Green I荧光定量RT-PCR并通过Ct值、标准曲线斜率、相关系数、扩增效率及扩增准确性等指标确定最佳反应体系及扩增程序；以优化的SYBR Green I荧光定量RT-PCR检测2019年6—10月在广西边境地区采集的139份蚊样品，获得的新型AKAV经测序后采用ClustalW构建遗传进化树。【结果】SYBR Green I荧光定量RT-PCR最佳反应体系：SYBR Premix Ex Taq II 10.0 μL，上、下游引物（4 μmol/L）各1.0 μL，标准品或反转录产物2.0 μL，双蒸水补齐至20.0 μL。扩增程序：95 ℃预变性30 s；95 ℃30 s，64 ℃（S基因）/66 ℃（M基因）30 s，72 ℃ 30 s，进行40个循环。SYBR Green I荧光定量RT-PCR检测新型AKAVS基因和M基因的极限为1.0×101 copies/µL和1.0×102 copies/µL，对应的扩增效率分别为98.61%和105.81%，但不能扩增蓝舌病病毒、鹿流行性出血热病毒、竹鼠圆环病毒和布鲁氏杆菌；检测S基因和M基因的批内重复试验、批间重复试验变异系数（CV）均低于5.00%。采用建立的SYBR Green I荧光定量RT-PCR成功从广西边境地区防城港市、东兴市、宁明县、大新县及北海市的阿蚊和库蚊中检出新型AKAV，且均属于基因Ia型，尤其与广东和湖南蠓虫、中华按蚊、致倦库蚊分离毒株具有较高的相似性。【结论】针对新型AKAV S基因和M基因建立的SYBR Green I荧光定量RT-PCR具有特异性强、灵敏度高、重复性好的特点，更适用于检测病毒拷贝数低的样品。此外，从广西边境地区蚊样品中检出的AKAV毒株均为新型AKAV，属于基因Ia型，与广东和湖南蠓虫、中华按蚊、致倦库蚊分离毒株具有较高的相似性，推测新型AKAV已在广西周边省份流行。