猪δ冠状病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立与初步应用

• 作者: 朱静静 李炳晓 梁青青 王盼 王超群 舒燕 郑兰兰 魏战勇
• 来源期刊: 畜牧兽医学报
• 学科: 农学
• 关键词: 猪δ冠状病毒 TaqMan荧光定量RT-PCR 检测
• 年，卷（期）: 2019,（6）
• 所属期刊栏目: 预防兽医
• 页码范围: 1261-1267
• 页数: 7页
• 分类号: S852.659.6
• 字数: 4742字
• 语种: 中文
• DOI: 10.11843/j.issn.0366-6964.2019.06.016

摘要

本研究旨在建立一种灵敏、快速检测猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)的TaqMan荧光定量RT-PCR方法.参照GenBank中PDCoV有关基因序列,设计一对特异性引物用于扩增PDCoV M基因.将测序正确的基因片段克隆入pMD18-T载体,构建重组质粒作为建立标准曲线的病毒模板.设计合成一对特异性引物与TaqMan探针,进行反应条件和反应体系的优化,建立快速检测PDCoV的TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法,并进行该方法的灵敏性、特异性与重复性验证.结果 表明,该方法能有效扩增1.0×101～1.0×109拷贝·μL-1的PDCoV标准质粒,建立的标准曲线呈现良好的线性关系.该方法的检测灵敏度为1.0×101拷贝·μL-1;对猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪伪狂犬病病毒等病原不发生交叉反应,具有很好的特异性;重复性试验结果显示变异系数(CV)小于1％,重复性良好.对2017-2018年期间收集的河南省不同猪场的100份腹泻病料进行检测,PDCoV的阳性检出率为23％(23/100),与PDCoV SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测方法的符合率为100％.人工感染PDCoV的仔猪,取攻毒后不同时间的粪便样品,应用本研究建立方法与常规RT-PCR方法对样品进行检测,TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的灵敏度远远优于常规RT-PCR.上述结果表明,本研究所建立的TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法能够灵敏、特异地检测PDCoV,可用于临床PDCoV的检测.