利用内标为基础的苹果锈果类病毒RT-PCR检测技术

• 作者: 吕运霞 曹克强 李楠 杨金凤 王亚南 王亚迪 王树桐 王雪静 胡同乐
• 来源期刊: 林业与生态科学
• 关键词: 苹果锈果类病毒 RT-PCR nad5 分布部位
• 年，卷（期）: 2017,（1）
• 所属期刊栏目: 果树与病虫害防治
• 页码范围: 51-56
• 页数: 6页
• 分类号: S432.4
• 语种: 中文
• DOI: 10.13320/j.cnki.hjfor.2017.0010

摘要

为开发准确、灵敏的苹果锈果类病毒(Apple scar skin viroid,ASSVd) RT-PCR检测方法,以田间染病苹果组织为试材,提取高质量总RNA为模板,在常规RT-PCR检测体系中引入苹果线粒体nad5基因作为内标基因,对RT-PCR反应体系和程序进行优化,并测定其灵敏度和稳定性,最后利用优化的检测体系确定苹果果实着色期最佳检测部位.结果表明:以RNA提取改良法提取总RNA为模板合成cDNA后,进行PCR扩增,优化后的PCR体系(25 μL)中cDNA模板2μL、ASSVd (20 pmol/μL)正反向引物各1.0μL,nad5(20pmol/μL)正反向引物各0.1μL;扩增程序中退火温度为60.9℃,循环次数为35次;检测灵敏度为37.5 ng新鲜样本;果实着色期,染病植株的幼嫩叶片、1 a生枝的韧皮部和木质部、果实及部分种子样本均能检测到病毒,最佳检测部位为幼嫩韧皮部.研究结果可以为ASSVd高效、快速、准确的检测提供可靠方法,并为田间病害诊断及无毒苗木繁育提供依据和借鉴.