胞壁酰二肽对体外奶牛乳腺上皮细胞生长及胞内NOD2 mRNA表达的影响

• 作者: 刘东宇 单旭菲 张旭 徐丹丹 王乐 王建发 王晓雅 许小楠 陈嘉
• 来源期刊: 中国农业科学
• 关键词: 奶牛乳腺上皮细胞 MDP NOD2
• 年，卷（期）: 2017,（3）
• 所属期刊栏目: 畜牧·兽医·资源昆虫
• 页码范围: 574-581
• 页数: 8页
• 语种: 中文

摘要

[目的]奶牛乳房炎是奶牛养殖业中最为常见,同时也是带来经济损失最为严重的疾病之一,其主要病因是细菌感染.奶牛乳腺的固有免疫是抵抗病原菌入侵的第一道防线.NOD2是机体固有免疫模式识别受体核苷酸结合寡聚域(nucleotide-binding oligomerization domain,NOD)蛋白家族中的重要一员,通过识别其特异性配体胞壁酰二肽(muramyl dipeptide,MDP)——一种广泛存在于革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌细胞壁中的成分,而参与抵抗多种病原菌入侵.奶牛乳腺上皮细胞(bovine mammary epithelial cells,BMEC)除泌乳以外,还是奶牛乳腺的免疫屏障.本试验欲探究MDP对BMEC体外生长状态及胞内NOD2表达量的影响.[方法]选取健康泌乳中期荷斯坦奶牛乳腺腺泡为组织原材料,采用胶原酶Ⅰ消化法结合梯度浓度胰蛋白酶纯化法分离BMEC;使用上皮细胞特异性表达的角蛋白-18(cytokeratin-18,CK-18)及成纤维细胞特异性表达的波形蛋白(Vimentin)抗体,通过免疫荧光技术对纯化后获得的细胞进行鉴定;将BMEC设为6个处理组,分别添加浓度为0(空白对照组)、1、5、10、15及20μg·mL-1的MDP,24 h后显微镜下观察细胞状态,同时提取细胞RNA并反转录为cDNA,采用实时荧光定量PCR方法检测BMEC中NOD2的表达量.[结果](1)胶原酶Ⅰ消化法结合梯度浓度胰蛋白酶纯化法分离得到的细胞CK-18免疫荧光结果为阳性,而Vimentin反应为阴性;细胞生长状态良好.(2)空白对照组、1、5及10μg·mL-1 MDP刺激组的BMEC生长状态良好,无任何肉眼可见变化;15μg·mL-1 MDP刺激组可见少量的BMEC脱落;而20μg·mL-1MDP刺激组可见大量BMEC脱落,漂浮,且即使仍贴壁的细胞,其形态也发生了变化.(3)与空白对照组相比,各刺激组细胞NOD2 mRNA的表达量与MDP的刺激浓度呈正相关,即刺激时间为24 h时,随着MDP浓度的增加,BMEC中NOD2受体mRNA的表达量逐渐增加(P<0.05).[结论]成功获得了纯度较好的BMEC,该细胞生长状态良好,可以用于后续试验;虽然BMEC中NOD2受体mRNA的表达量与MDP的刺激浓度呈正相关,但在保持BMEC生长状态正常的前提下,MDP体外刺激浓度应控制在10μg·mL-1以下.这些结果提示我们:当病原菌入侵乳腺时,BMEC可以通过NOD2受体途径参与免疫防御反应,但这种防御能力受细菌数量或毒力强度的影响.即在一定的细菌数量或毒力范围内,随着细菌数量的增加或毒力的增强,奶牛乳腺的免疫防御反应也增强,进而清除外来病原菌;而当细菌数量或毒力强度超过一定范围时,乳腺组织受到严重损伤,免疫防御屏障也随之崩溃,奶牛乳腺局部甚至全身将呈现出明显的临床症状.