硒对S.aureus诱导的奶牛乳腺上皮细胞Nod2/MAPK/mTORs信号通路关键蛋白表达的影响

• 作者: 关立增 刘俊俊 毕崇亮 王亨 王娟 韩照清
• 来源期刊: 中国农业科学
• 关键词: 硒 金黄色葡萄球菌 Nod2/MAPK/mTORs 奶牛乳腺上皮细胞
• 年，卷（期）: 2019,（16）
• 所属期刊栏目: 畜牧·兽医·资源昆虫
• 页码范围: 2891-2898
• 页数: 8页
• 字数: 4262字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2019.16.014

摘要

[目的]硒(Se)能否通过Nod2/MAPK/mTOR途径调控金黄色葡萄球菌诱导的奶牛乳腺上皮细胞炎性损伤,有待于进一步研究.因此本研究将探究硒对金黄色葡萄球菌(S.aureus)感染的奶牛乳腺上皮细胞(bMECs)Nod2/MAPK/mTORs信号通路中关键蛋白表达的影响,从而为阐明硒的免疫调控机制提供理论依据.[方法]首先将bMECs以1 06细胞/孔接种于6孔板中,当细胞超过80％的汇合度时,用含2、4和8μmo 1·L-1浓度硒的培养基替换原来的培养基,继续孵育12h,然后用PBS洗涤每孔3次,将S.aureus按MOI=1∶1的比例加入6孔板中,继续培养0.5h,然后收集bMECs细胞进行相关蛋白的检测.本试验共分3大组,即对照(Con)组(bMECs)、模型(Mod)组(bMECs+S.aureus)和试验组.其中试验组又分3个亚剂量组,即Low组(bMECs+2 μmol·L-1 Se+S.aureus)、Mid组(bMECs+4 μmol·L-1 Se+S.aureus)和Hig组(bMECs+8 μmol·L-1 Se+S.aureus),每组设3个重复.利用BCA蛋白测定试剂盒对收集的bMECs细胞进行总蛋白提取.应用Western blotting技术检测bMECs中Nod2和RIP2蛋白表达水平及JNK,AKT和mTOR蛋白磷酸化水平.将蛋白样品加到10％的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳中,上样量为20 μg/孔,之后将蛋白转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上.将PVDF膜用5 mL 5％脱脂乳阻断2h,脱脂乳脱脂后用TBST清洗后,分别用5 mL的Nod2、RIP2、JNK、AKT、mTOR和p-actin的一抗孵育过夜,回收一抗.之后在PVDF膜中分别加入5 mL上述蛋白的二抗,室温孵育2h,回收二抗.PVDF用TBST洗涤5次,最后在暗室条件下进行化学显影.[结果]S.aureus能显著提高bMECs中Nod2和RIP2蛋白表达水平及JNK,AKT和mTOR蛋白磷酸化水平(P＜ 0.01).S.aureus感染0.5h后,Nod2蛋白水平显著升高(P＜0.01).在培养基里添加2μmol·L-1的硒可极显著抑制Nod2蛋白的表达(P＜0.01),在培养基里添加8 μmol·L-1的硒可显著抑制Nod2的表达(P＜0.05);S.aureus感染0.5h后,RIP2蛋白水平显著升高(P＜0.05),而在培养基里添加8 μmol·L-1硒可显著抑制RIP2蛋白的表达(P＜ 0.05);S.aureus感染0.5h后,与对照组相比,模型组JNK蛋白磷酸化水平显著升高(P＜ 0.01).在培养基里添加4 μmol·L-1的硒能显著抑制JNK蛋白的磷酸化水平(P＜0.05),在培养基里添加8μmol·L-1的硒能显著抑制JNK蛋白的磷酸化水平(P＜ 0.01);S.aureus感染0.5h后,与对照组相比,模型组AKT蛋白磷酸化水平显著升高(P＜ 0.01).在培养基里添加4 μmol·L-1硒可极显著抑制JNK蛋白的磷酸化水平(P＜ 0.01),在培养基里添加8 μmol·L-1硒可显著抑制AKT蛋白的磷酸化水平(P＜0.05);S.aureus感染0.5h后,模型组mTOR蛋白磷酸化水平显著升高(P＜ 0.01).在培养基里分别添加4μmol·L-1和8μmol.L-1硒均能显著抑制mTOR蛋白磷酸化水平(P＜ 0.05).[结论]硒可通过抑制bMECs Nod2/MAPK/mTORs信号通路中关键因子蛋白的表达而减轻S.aureus诱导的bMECs炎症反应.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	王亨	扬州大学兽医学院	51	119	6.0	9.0
3	关立增	临沂大学农林科学学院	10	0	0.0	0.0
4	王娟	临沂大学农林科学学院	10	1	1.0	1.0
5	韩照清	临沂大学农林科学学院	4	3	1.0	1.0
6	毕崇亮	临沂大学农林科学学院	4	0	0.0	0.0
9	刘俊俊	扬州大学兽医学院	2	0	0.0	0.0