GPNMB通过调控MITF下游色素相关基因表达影响黑色素细胞色素的生成

• 作者: 刘颖 常露程 李亚楠 王海东 范瑞文 董常生 薛霖莉 赵兵令 陈天直
• 来源期刊: 中国农业科学
• 关键词: GPNMB MITF 黑色素细胞 黑色素生成
• 年，卷（期）: 2017,（7）
• 所属期刊栏目: 畜牧·兽医·资源昆虫
• 页码范围: 1334-1342
• 页数: 9页
• 语种: 中文
• DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2017.07.016

摘要

[目的]探究GPNMB是否会通过调控MITF及其下游色素相关基因的表达来影响黑色素细胞中色素的生成,为进一步阐明GPNMB对黑色素细胞中色素生成的具体机制提供理论依据.[方法]首先对小鼠GPNMB核酸序列进行检索,通过对GPNMB和慢病毒表达载体序列分析来筛选出合适的酶切位点,在此选取Sa1Ⅰ和Xba Ⅰ作为酶切位点.并对GPNMB基因序列设计含有Sa1Ⅰ和Xba Ⅰ酶切位点的全长引物,克隆GPNMB基因全长序列,将含有酶切位点的GPNMB基因片段与T载体进行连接,送华大基因测序.将构建成功的T载体提取质粒,双酶切后将其与含有绿色荧光蛋白(GFP)的慢病毒表达载体相连接,送华大基因进一步测序确认.使用质粒中提试剂盒获得大量去内毒素的GPNMB慢病毒真核表达载体.通过体外培养小鼠黑色素细胞,选择细胞对数生长期利用细胞转染技术过量表达GPNMB.观察转染后黑色素细胞形态特征变化和绿色荧光蛋白的表达量,收集黑色素细胞,并对其进行转染效率验证,黑色素含量进行测定,以及经Real-time PCR和Western blot检测转染后PMEL、MITF、TYR、TYRP1、TYRP2和OA1的mRNA和蛋白的表达量.[结果]与正常组(Control)相比试验组(Vector-GFP-GPNMB)、空载组(Vector-GFP)中黑色素细胞的形态特征无明显变化,并且试验组、空载组的绿色荧光蛋白表达量显示5 μg DNA/孔转染效率最高.相对于空载组和正常组,试验组的GPNMB mRNA和蛋白水平都显著的升高(P＜0.01).与空载组相比,试验组黑色素含量升高1.34倍,差异显著(P＜0.01).Real-time PCR检测结果显示,MITF mRNA显著降低2.25倍(P＜0.01);PMEL mRNA显著升高1.59倍(P＜0.05);TYRP1 mRNA显著升高2.35倍(P＜ 0.01);TYRP2 mRNA显著升高1.60倍(P＜ 0.01);TYR mRNA升高1.65倍和OA1 mRNA升高1.5倍,但变化不明显.Western blot检测结果显示,MITF蛋白显著降低1.59倍(P＜0.01);TYR蛋白显著升高1.23倍(P＜0.01);TYRP2蛋白显著升高4.35倍(P＜0.01);OA1蛋白显著升高1.31倍(P＜ 0.05);TYRP1蛋白升高1.05倍,但变化不明显.[结论]GPNMB过量表达使MITF下游基因PMEL、TYR、TYRP1、TYRP2和OA1的表达量增加,却使MITF的表达量降低,由此表明GPNMB可能受非MITF调控路径调节PMEL、TYR、TYRP1、TYRP2和OA1的表达,从而影响黑色素的生成.