绿盲蝽AlEcR-A的单克隆抗体制备及在外源20E诱导下的应答

• 作者: 孙洋 柏立新 肖留斌 谭永安 赵静 郝德君
• 来源期刊: 中国农业科学
• 关键词: 绿盲蝽 蜕皮激素受体 20-羟基蜕皮酮 单克隆抗体 表达量
• 年，卷（期）: 2017,（1）
• 所属期刊栏目: 植物保护
• 页码范围: 86-93
• 页数: 8页
• 语种: 中文
• DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2017.01.008

摘要

[目的]获得绿盲蝽(Apolygus lucorum)蜕皮激素受体(AlEcR-A)原核表达的重组蛋白,制备单克隆抗体,分析绿盲蝽AlEcR-A在外源蜕皮激素(20E)诱导下mRNA及蛋白表达量的变化趋势,为进一步研究EcR的功能奠定前期基础,同时也为构建20E信号传导的网络图谱提供理论依据.[方法]在前期获得绿盲蝽AlEcR-A的基础上,将含有其基因的T载体经Nde I和XbaI双酶切,构建AlEcR-A原核表达载体(pCzn1-AlEcR-A),将该表达载体经IPTG诱导表达和蛋白Ni-IDA亲和纯化,以获得AlEcR-A基因功能区的纯化蛋白.进一步用其进行免疫反应,取小鼠的脾细胞与SP2/0细胞进行细胞融合,采用间接ELISA及Western blot筛选验证是否为目的抗体,通过抗体纯化,Western blot检测该抗体能否特异性结合AlEcR-A重组蛋白及绿盲蝽总蛋白,从而制备得到AlEcR-A蛋白单克隆抗体.最后利用RT-PCR及Western blot方法,进行20E微注射绿盲蝽2龄若虫,分析8 d内AlEcR-A的mRNA及蛋白含量的变化,明晰20E诱导下AlEcR-A的应答反应.[结果]经Nde I和XbaI双酶切后原核表达载体pCzn1-AlEcR-A在大肠杆菌Arctic express中能高效表达一个约为55 kD的蛋白,且该重组蛋白经IPTG诱导后主要以包涵体的形式存在;经Ni-IDA亲和层析后,pCzn1-AlEcR-A重组蛋白的包涵体纯度仅在55 kD附近有一条明显的特异性条带,说明靶蛋白已得到纯化.进一步通过小鼠免疫、细胞融合及腹水制备,获得了1株能稳定分泌抗AlEcR-A蛋白单克隆抗体的细胞株,命名为8H7;Western blot分析表明,该细胞株不仅能与绿盲蝽总蛋白结合,还可特异性与AlEcR-A重组蛋白反应,且条带大小一致,说明制备的AlEcR-A单克隆抗体准确、有效;RT-PCR及Western blot结果表明,与注射蒸馏水相比,20E微注射处理后的绿盲蝽AlEcR-A mRNA表达量及蛋白表达量均显著升高,且随着处理时间的延长,其增值幅度也逐渐增高.[结论]获得了一株高特异性的能稳定分泌AlEcR-A单克隆抗体的细胞株,20E有诱导AlEcR-A mRNA及蛋白表达的作用.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	肖留斌	江苏省农业科学院植物保护研究所	44	434	12.0	17.0
2	柏立新	江苏省农业科学院植物保护研究所	68	747	15.0	22.0
3	谭永安	江苏省农业科学院植物保护研究所	36	353	10.0	17.0
4	郝德君	南京林业大学林学院	46	344	11.0	16.0
5	孙洋	江苏省农业科学院植物保护研究所	16	121	7.0	10.0
6	赵静	江苏省农业科学院植物保护研究所	7	29	3.0	5.0