Marinacarbolines甲基化基因mcbD的筛选及其功能

• 作者: 李青连 秦湘静 陈奇 鞠建华
• 来源期刊: 微生物学报
• 关键词: marinacarboline 甲基化 生物合成 酶反应
• 年，卷（期）: 2017,（7）
• 所属期刊栏目: 研究报告
• 页码范围: 1095-1105
• 页数: 11页
• 语种: 中文
• DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20160450

摘要

[目的]定位Marinactinospora thermotolerans SCSIO 00652基因组中负责marinacarbolines甲基化修饰的基因mcbD并鉴定其功能.[方法]游离M.thermotolerans SCSIO 00652的基因组序列中功能注释为甲基转移酶的蛋白,使用MEGA 6自带的ClustalW与来自于marformycins生物合成途径中的MfnG(D/L-酪氨酸甲基化酶)进行多序列比对,用邻接法(Neighbor-Joining)构建系统进化树,筛选到与MfnG进化关系最近的Orf03255 (McbD);扩增mcbD后克隆至pET28a(+)并在E.coli BL21 (DE3)中表达,结合Ni-NTA亲和层析法纯化获取较高纯度的McbD活性蛋白;以marinacarboline B为底物,利用高效液相色谱检测McbD的体外酶活;利用基于PCR-targeting的遗传操作体系构建mcbD插入失活突变株(△mcbD)并分析其与野生型菌株的发酵产物差异.[结果]N-末端融合组氨酸标签的McbD蛋白在E coli BL21(DE3)中可溶性表达,亲和层析纯化的McbD能够以marinacarboline B为底物催化形成marinacarboline C;mcbD基因阻断突变株△mcbD与野生型相比不产生化合物marinacarboline C,同时累积marinacarboline B.[结论]McbD为marinacarbolines生物合成中必需的O-甲基转移酶.