猪Rosa26位点敲入Loxp修饰的hCD55成纤维细胞系的建立

• 作者: 刘霞 张译夫 张超 朱辉斌 杜敏杰 潘登科 王煜 石宁宁 高景波
• 来源期刊: 农业生物技术学报
• 学科: 农学
• 关键词: 猪 pRosa26 hCD55 CRISPR/Cas9 异种移植 Loxp
• 年，卷（期）: 2018,（6）
• 所属期刊栏目: 专题:异种器官移植的基因修饰小型猪
• 页码范围: 1074-1083
• 页数: 10页
• 分类号: S813.3|Q812
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1674-7968.2018.06.018

摘要

人补体调节蛋白(human complement regulatory protein,hCRP)基因,如人类簇分化抗原55(human cluster of differentiation 55,hCD55),在异种器官移植中尤为重要.本研究在α-1,3半乳糖苷转移酶(α-1,3-galactosyltransferase,GGTA1)基因敲除(α-1,3-galactosyltransferase knockout,GTKO)巴马小型猪(Susscrofa)耳成纤维细胞的基础上,利用CRISPR/Cas9技术在猪Rosa26 (reverse orientation splice acceptorβ-geo26)基因座敲入hCD55基因,以制备hCD55基因高效表达的细胞系.分别构建靶向切割pRosa26位点intron 1(内含子1)的Cas9表达载体,及pRosa26位点同源重组hCD55的表达载体,后者包含异源Loxp位点间的EF1α(polypeptide chain elongation factor 1 α)启动子调控的hCD55基因、潮霉素B磷酸转移酶基因(hygromycin B phosphotransferase,HPH)、胸腺激酶基因(thymidine kinase,TK)为正负筛选基因.将Cas9-Rosa26表达载体和pEF1α-hCD55表达载体共电转染猪耳成纤维细胞系,培养液中加入丙氧鸟苷(Ganciclovir,GCV)和潮霉素(hygromycin,Hyg)进行筛选,培养至单细胞克隆.通过跨5’端和3’端同源臂的两对引物PCR检测目的基因整合情况,反转录(reverse transcription PCR,RT-PCR)和Western blot检测hCD55在细胞中的表达情况.药物筛选后得到94个克隆点,经PCR鉴定,定点整合hCD55的阳性克隆点2个,定点整合效率为2.1％.RT-PCR结果显示,阳性克隆点细胞表达hCD55基因,Western blot结果进一步证实hCD55在细胞有表达.本研究在GTKO巴马小型猪耳成纤维细胞系基础上成功构建了表达目的基因hCD55的细胞系,为异种移植供体猪的制备提供了基础资料.