夹心ELISA检测微小隐孢子虫抗原方法的建立及初步应用

• 作者: 刘珍珍 宁长申 张璐 张龙现 王荣军 菅复春 陈凯丽
• 来源期刊: 中国人兽共患病学报
• 学科: 农学
• 关键词: 隐孢子虫 双抗体夹心ELISA 检测
• 年，卷（期）: 2018,（3）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 230-235,247
• 页数: 7页
• 分类号: S855.9
• 字数: 4476字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1002-2694.2018.00.040

摘要

目的 建立检测隐孢子虫的夹心 ELISA方法.方法 本试验以纯化的抗隐孢子虫 IgG、IgY分别作为包被抗体和捕获抗体,棋盘滴定法确定夹心 ELISA的最适工作条件.用基于18SrRNA的PCR方法评估饱和蔗糖溶液、饱和食盐水漂浮和PBST洗涤剂洗涤3种方法预处理样品对夹心 ELISA检测效果的影响.结果 建立的夹心 ELISA 捕获抗体、抗原、检测抗体、酶标二抗最佳工作浓度分别是1:800、2.5 μg/mL、1:100和1:5000,最适捕获抗体包被、抗原抗体反应、酶标二抗反应条件分别为37 ℃作用1 h后4 ℃过夜、37 ℃作用30 min、45 min;最适终止条件是2 mol/L H2SO4,50 μL/孔;TMB室温显色10 min;特异性试验结果显示仅可以检出隐孢子虫抗原,而与常见肠道寄生的球虫卵囊、圆线虫和蛔虫虫卵无交叉反应.批间和批内变异系数均小于10%.3种方法前处理粪便用于 ELISA检测与 nested-PCR检测结果总符合率分别为95.83%、91.67%和83.33%,以饱和蔗糖溶液漂浮法处理检测样品的效果最佳.与爱德士的隐孢子虫检测试剂盒比较,结果显示,本方法敏感性低于爱德士试剂盒的最低检出量(6×103个/mL),整个试验过程比试剂盒多用15 min,但特异性和重复性均一致,且本试验方法更加经济实用.结论 该方法简便,快速,灵敏,可用于临床粪样中隐孢子虫病原检测或隐孢子虫流行病学调查研究.