鸡FGF8基因RNA干扰载体的构建及其对PGCs形成的影响

• 作者: 孙长花 左其生 张亚妮 张文慧 李东 李婷婷 李碧春 王曼 金晶 陈国宏
• 来源期刊: 农业生物技术学报
• 学科: 农学
• 关键词: 鸡 成纤维生长因子8基因(FGF8) 胚胎干细胞(ESC) 原始生殖细胞(PGC) 短发夹RNA(shRNA)
• 年，卷（期）: 2018,（9）
• 所属期刊栏目: 研究论文与报告
• 页码范围: 1457-1466
• 页数: 10页
• 分类号: S831.2|Q254
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1674-7968.2018.09.001

摘要

原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs)作为精细胞的祖细胞,广泛用于研究精子的发生.成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGF)家族对PGCs的形成至关重要.为了探究成纤维生长因子8(FGF8)的具体功能,本研究通过构建家鸡(Gallus domesticus) FGF8的短发夹RNA (short hairpin RNA,shRNA)慢病毒干扰载体,获得稳定低表达FGF8的鸡胚胎干细胞株,并进一步研究FGF8在鸡胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)向PGCs分化中的功能.根据家鸡FGF8的转录本设计3个RNA干扰靶点,连接到pGMVL-SC5干扰载体,瞬时转染鸡胚成纤维细胞DF1.以qRT-PCR技术检测各靶点对FGF8的干扰效率,将干扰效率最佳的shRNA载体进行慢病毒包装.在以慢病毒敲低FGF8的ESCs中进行视黄酸(retinoic acid,RA)诱导,观察各组细胞形态变化,收集不同时间的各组细胞,利用qRT-PCR、间接免疫荧光以及流式细胞术等方法,分析检测生殖相关标记基因的表达变化和PGCs形成效率.结果表明,FGF8慢病毒干扰载体构建成功,分别命名为shFGF8-1、shFGF8-2、shFGF8-3,其中shFGF8-2干扰效率最佳.将shFGF8-2进行慢病毒包装,获得滴度为5×108 TU/mL、干扰效率为(70±4.31)％的慢病毒载体.对于FGF8表达抑制的ESCs,体外RA诱导4d后,PGC样细胞显著增加,ESC标记基因Nanog表达极显著下调(P＜0.01),PGC标记基因Cvh C-kit表达极显著上调(P＜0.01).此外,免疫荧光及流式细胞术分析结果也进一步证实,诱导4d后与对照组比较,FGF8低表达使CVH+PGCs比例显著增加(P＜0.01).本研究成功构建了稳定转染鸡胚胎干细胞的FGF8特异性慢病毒载体,并证实FGF8在体外参与调控PGCs的形成.