一个甘蔗Ⅱd类WRKY转录因子基因的克隆和表达分析

• 作者: 凌辉 刘峰 张旭 李聪娜 毛花英 汤翰臣 王玲 苏亚春 苏炜华 阙友雄 黄宁
• 来源期刊: 中国农业科学
• 关键词: 甘蔗 WRKY转录因子 外源胁迫 实时荧光定量PCR
• 年，卷（期）: 2018,（23）
• 所属期刊栏目: 作物遗传育种·种质资源·分子遗传学
• 页码范围: 4409-4423
• 页数: 15页
• 语种: 中文
• DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2018.23.002

摘要

[目的]WRKY是植物特有的一类转录因子,在生理调控和逆境响应过程中有着重要作用.通过分析WRKY转录因子基因在甘蔗生长发育及抗逆境过程中的作用,为甘蔗抗逆分子育种提供优良的基因资源.[方法]从甘蔗转录组数据库中挖掘到一条WRKY基因Unigene序列,并通过RT-PCR扩增得到cDNA全长序列,利用ORF finder、Smart、ExPaSy、Prabi、NetPhos、Cell-PLOC 2.0和DNAMAN6.0软件对该基因序列及其编码蛋白序列进行生物信息学分析,并使用MEGA6.0软件构建系统进化树;构建pCAMBIA1300-WRKY-GFP融合表达载体,通过农杆菌转化本氏烟(Nicotiana benthamiana),确定WRKY蛋白在烟草叶片中的亚细胞定位;利用酵母杂交试验验证WRKY是否具有转录自激活活性;采用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)方法分析WRKY在甘蔗品种ROC22中的组织特异性(根、蔗芽、叶、蔗髓和皮)及其在MeJA(100 μmo l·L-1)、SA (5 mmol·L-1)、PEG (25％)、NaCl (250 mmol·L-1)、CuCl2(500 mmo 1·L-1)和CdCl2 (500 mmol·L-1)胁迫条件下表达量的变化.[结果]从甘蔗品种ROC22中克隆获得一个WRKY转录因子基因,命名为Sc WRKY6(GenBank登录号为MH393927).该基因序列全长1 289 bp,包含1个1 059 bp的ORF,编码352个氨基酸,并具有45个磷酸化位点;理论等电点为9.73,不稳定指数为50.23,亲水性为-0.579,推测其为碱性不稳定亲水性蛋白.ScWRKY6蛋白具有1个WRKY结构域和1个锌指结构域(CX5CX23HXH),该蛋白氨基酸序列与高粱(Sorghum bicolor)WRKY (XP_002464211.1)的同源性最高,根据系统进化树分析可以推测其属于WRKY家族Ⅱ d亚类.亚细胞定位结果显示,ScWRKY6∷GFP融合蛋白定位在细胞核上.酵母转录激活验证试验显示,ScWRKY6蛋白不具有转录自激活活性.qRT-PCR分析表明,ScWRKY6在甘蔗中为组成型表达,其表达量由大到小依次为蔗芽、叶、根、皮和蔗髓,其中蔗芽、叶和根的表达量分别为蔗髓的2.05、1.55和1.37倍.ScWRKY6在NaCl、PEG、MeJA、重金属Cu2+和Cd2+胁迫诱导下表达量均上调,其在NaCl处理12 h时表达量最高,为对照的4.18倍;在PEG处理3h时表达量最高,为对照组的6.88倍;在CuCl2和CdCl2诱导24 h时表达量最高,分别为对照组的3.63倍和4.86倍.[结论]ScWRKY6蛋白定位在细胞核上,不具有转录自激活活性;该基因在甘蔗不同组织部位中均有表达,且受NaCl、PEG、CuCl2和CdCl2等胁迫的诱导,推测ScWRKY6可能在甘蔗干旱应答、耐盐及金属离子胁迫响应中发挥作用.