蛋白转导结构域4-铜/锌-超氧化物歧化酶融合蛋白的制备及其穿细胞膜的功能研究

• 作者: 刘菊英 李瑞明 柯昌斌 王宇 王晓勋 王贤裕
• 来源期刊: 安徽医药
• 关键词: 铜/锌-超氧化物歧化酶 蛋白转导结构域 心肌细胞
• 年，卷（期）: 2018,（2）
• 所属期刊栏目: 药学研究
• 页码范围: 220-224
• 页数: 5页
• 字数: 4405字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1009-6469.2018.02.007

摘要

目的 拟构建蛋白转导结构域(PTD)4-铜/锌-超氧化物歧化酶(Cu/ZnSOD)原核表达质粒,纯化制备PTD4-Cu/ZnSOD融合蛋白,探讨其穿膜能力.方法 设计合成hCu/ZnSOD引物,扩增hCu/ZnSOD cDNA片段;采用PCR靶向克隆法将扩增产物与含有相同酶切位点载体质粒PET16b-PTD4进行重组,扩增质粒,双酶切鉴定和DNA测序;获得PET16b-PTD4-Cu/ZnSOD(CDs)原核表达载体,导入感受态E.coli BL21(DE3)中,进行扩增培养,收集菌体,将其裂解离心、Ni+2亲和层析、收集目的蛋白.融合蛋白孵育人心肌细胞,免疫荧光法检测融合蛋白穿膜能力.结果 通过测序证实实验扩增所得的PTD序列与设计的预期序列一致.设计并简并PTD4-Cu/ZnSOD基因长度为567 bp,通过引物进行正反向测序证实该序列与已被登录的GEN-BANK中Cu/ZnSOD序列相一致,并构建了相应的原核表达质粒.并在E.coli BL21进行大量表达,最终收集的PTD4-Cu/Zn-SOD具有良好水溶性.SDS-page分析显示构建的PTD4-Cu/ZnSOD分子量约为20 kDa,与预期的蛋白分子量20.45 kDa相符合.融合蛋白可以穿透心肌细胞胞膜,进入细胞后主要分布在胞质和胞核内并具有天然活性.结论 成功地构建了PET16b-PTD4-Cu/ZnSOD原核表达质粒,获得了可穿透心肌细胞膜的PTD4-Cu/ZnSOD融合蛋白,为应用Cu/ZnSOD治疗缺血性疾病的研究奠定了基础.