GST pull-down验证新城疫病毒基质蛋白与鸡importin β1蛋白的相互作用

• 作者: 嵇辛勤 李世静 段志强 熊建民 胡焱 赵佳福 邓珊珊
• 来源期刊: 畜牧兽医学报
• 学科: 农学
• 关键词: 新城疫病毒 基质蛋白 importin β1蛋白 GST pull-down 蛋白相互作用
• 年，卷（期）: 2019,（1）
• 所属期刊栏目: 预防兽医
• 页码范围: 126-133
• 页数: 8页
• 分类号: S855.3
• 字数: 6474字
• 语种: 中文
• DOI: 10.11843/j.issn.0366-6964.2019.01.015

摘要

旨在利用GST pull-down技术验证新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)基质(matrix,M)蛋白与鸡importin β1蛋白在体外的相互作用.根据NDVZJ1株M基因和鸡importin β1基因序列设计引物,通过PCR扩增获得NDV M基因和鸡importin β1基因,将其分别定向插入到原核表达载体pGEX-6p-1和pET-32a(+)构建重组原核表达载体pGEX-6p-M、pET-32a-importinβ1,然后转化至大肠杆菌BL21 (DE3)后进行IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测重组蛋白的表达情况,并对包涵体重组蛋白进行变性和复性处理.然后以GST-M重组蛋白为诱饵蛋白,His-importin β1重组蛋白为猎物蛋白,利用GST pull-down技术验证M蛋白与importinβ1蛋白的相互作用.结果表明,成功构建了重组原核表达载体pGEX-6p-M和pET-32a-importinβ1,将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)获得了正确表达.SDS-PAGE电泳检测显示GST-M重组蛋白主要以包涵体形式存在,而His-importin β1重组蛋白以可溶性和包涵体两种形式存在.利用蛋白重折叠试剂盒获得了有活性的GST-M重组蛋白,将其作为诱饵蛋白,可以捕获并检测到His-importin β1重组蛋白,但是GST标签蛋白不能结合His-importin β1重组蛋白.利用GSTpull-down技术证实了NDV M蛋白与鸡importin β1蛋白在体外具有直接的相互作用,这为深入研究importin β1蛋白在NDV M蛋白细胞核定位的分子机制以及在NDV复制和致病中的作用奠定了基础.