鲤浮肿病病毒环介导等温扩增(LAMP)检测方法的建立

• 作者: 刘文枝 周勇 曾令兵 江南 翟立文 范玉顶 许晨
• 来源期刊: 中国水产科学
• 学科: 农学
• 关键词: 鲤浮肿病病毒 核蛋白编码基因P4a 环介导等温扩增 检测 优化
• 年，卷（期）: 2019,（5）
• 所属期刊栏目: 研究论文
• 页码范围: 1004-1013
• 页数: 10页
• 分类号: S941
• 字数: 7061字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3724/SP.J.1118.2019.19066

摘要

本研究针对鲤浮肿病病毒(carp edema virus,CEV)基因组核蛋白编码基因P4a的序列,设计2对特异性引物,以克隆构建的重组质粒为标准模板,通过优化反应体系中引物浓度组合、Mg2+浓度、dNTPs浓度、反应温度和扩增时间等参数,建立了CEV环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测方法.结果表明,CEV-LAMP方法的最佳反应温度为62℃,引物浓度组合为引物F3/B30.2μmol/L,引物FIP/BIP 1.2μmol/L,Betaine 0.7 mol/L,Mg2+8.0 mmol/L,dNTPs 1.2 mmol/L,反应时间60 min.反应产物经凝胶电泳呈现梯型条带,添加SYBR Green I荧光染料后,呈现明显的绿色阳性反应.CEV-LAMP法灵敏度高,最低检测限为10 copies/μL,较常规PCR法灵敏度高100倍;CEV-LAMP法特异性强,与锦鲤疱疹病毒(KHV)、鲤疱疹病毒Ⅱ型(CyHV-2)、鳜传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)及鲤春病毒血症病毒(SVCV)无交叉反应.CEV-LAMP应用于患病鲤样本检测结果准确,简便快速,可为鲤浮肿病的现场诊断与防控提供技术支撑.