斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)病毒性神经坏死病毒的纯化分析及检测方法建立

• 作者: 吴丽云 吴建绍 吴水清 周宸 杨求华 林克冰 林琪 王艺磊 葛辉 郑乐云 黄种持
• 来源期刊: 渔业研究
• 学科: 农学
• 关键词: 斜带石斑鱼 神经坏死病毒 分离纯化 E11细胞系 大黄鱼肌肉细胞
• 年，卷（期）: 2019,（2）
• 所属期刊栏目: 论文与报告
• 页码范围: 96-105
• 页数: 10页
• 分类号: S917.4
• 字数: 5273字
• 语种: 中文
• DOI: 10.14012/j.cnki.fjsc.2019.02.002

摘要

根据GenBank中已有的鱼类病毒性神经坏死病毒(NNV) RNA2基因序列,设计引物,从福建厦门具有典型NNV发病症状的斜带石斑鱼中克隆了RNA2基因的全长序列,并将序列提交到GenBank获得登录号为MF510920,命名为XMNNV.系统进化树分析结果表明XMNNV与RGNNV聚类在一起,与SJNNV、BFNNV和TPNNV等其他鱼类神经坏死病毒亲缘关系较远,说明本研究分离得到的XMNNV属于RGNNV基因型.通过超速离心方法对病毒进行提纯,得到了纯化的NNV病毒.电镜观察结果表明,病毒粒子直径20 ～ 25 nm,结构为正二十面体,与已经报道的NNV结构一致.通过对XMNNV与其它RGNNV RNA2基因进行序列比对,在保守区设计引物,运用RT-PCR方法建立了RGNNV的PCR检测方法,该方法灵敏度高达67 copies/μL.纯化的病毒对E11(条纹月鳢细胞系)和大黄鱼肌肉细胞进行感染,结果表明该病毒可以感染这两种鱼类细胞.E11细胞被感染病毒后,细胞出现空泡化,并最终导致细胞分解死亡;大黄鱼肌肉细胞感染后,细胞变圆,慢慢从培养皿壁脱落,最终解体死亡.另外,对感染后细胞进行PCR检测,结果显示为阳性,进一步确定了分离的NNV具有感染这两种细胞的能力.本研究通过电镜观察和PCR检测两种方法确定了患病石斑鱼携带NNV,通过对两种鱼类细胞的感染实验,确定了该病毒具有一定的感染能力.综上,本研究为石斑鱼NNV疾病的诊断提供了有效的方法,对石斑鱼NNV疾病的预防具有一定的指导意义.